蛋白质与酶工程

蛋白质与酶工程重点

1.蛋白质工程：以蛋白质结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术或化学修饰技术对现有蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。

2.酶工程：利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。

3.酶工程研究的主要内容：1）化学酶工程 2）生物酶工程 3）固定化酶与细胞 4）酶反应器与传感器 5）酶的非水相催化

4.蛋白质的融合：将编码一种蛋白质的部分基因重组到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达产生新的融合蛋白。

5.蛋白质的融合的作用：1）用于表达产物的分离纯化；2）提高表达产物的溶解度；3）提高蛋白质稳定性。

6.蛋白质晶体学：利用X射线衍射技术，进行生物大分子结构研究的工程，是结构生物学的一个重要组成部分。

8.定点突变：通过分子克隆手段定点的改变特定基因的局部核苷酸序列，通常被用来研究蛋白质的功能结构以及用于目的蛋白的改造。

10.酶工程的研究范围：

1）各类自然酶的开发和生产；

2）酶的分离纯化和鉴定技术；

3）固定化技术；

4）利用其他的生物技术领域交叉渗透；

5）多酶反应器的研制和应用。

11.酶的稳定性和稳定化：

（一）引起酶失活的原因：

1）酶的活性中心一些特定氨基酸残基被化学修饰，使酶活性丧失（微观）；

2）外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍，使其不能与底物结合；

3）酶的高级结构发生变化（螺旋、折叠发生变化）；

4）多肽链的断裂（很强烈）；

（二）酶的稳定化：

1）低温保存（酶的本身不易变性，不易使其他酶把目的蛋白降解）；

2）添加盐类（高浓度(NH4)2SO4）；

3）添加底物辅酶等配体；

4）添加强变性剂（保护一级结构，使用时可复活）；

5）结晶化。

12.微生物作为酶源的优越性：

1）容易获得酶需要的酶类；

2）容易获得高产菌株；

3）生产周期短；

4）生产成本低；

5）生产易管理；

6）提高微生物产酶的途径比较多。

13.固定化酶：指在一定空间呈封锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。

14.固定化酶的优点：

1）极易将固定化酶与产物和底物分开；

2）可以在较长时间内进行反复的分批反应和装柱连续反应；

3）在大多数情况下能够提高酶的稳定性；

4）酶的反应过程能加以严格控制；

5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；

6）较游离酶更适合于多酶反应；

7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；8）酶的使用效率提高、成本降低。

15.固定化酶的缺点：

1）固定化时酶活力有损失；

2）增加了生产的成本，工厂初始投资大；

3）只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物；

4）与完整的菌体相比不适合多酶反应，特别是需要辅因子的反应；

5）胞内酶必须经过的分离手续。

16.固定化酶的制备原则：

1）必须注意维持酶的催化活性和专一性；

2）固定化应有利于生产的自动化和连续化；

3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍煤与底物的接近，以提高产品产量；

4）酶与载体必须结合力牢固，使固定化酶能够回收，储藏利于反复使用；

5）固定化酶应有最大的稳定性，所选的载体不与废物产物或反应液发生化学反应；

6）固定化酶成本要低，利于工业使用。

17.酶固定的方法：

（一）非共价结合法：

1）结晶法：适用于酶活性低的酶，结晶后浓度变化大，在不断的连续使用中没有所损耗；

2）分解法：将酶制成干粉，将其分散于水中不溶相中，即使干粉悬浮于溶剂上，优点：回收较方便，缺点：干粉易吸水，颗粒变大，活性降低，在有机溶剂中酶活力会受到影响；

3）物理吸附法：酶被物理吸附于不溶性载体的一种方法；优点：酶活性中心不容易被破坏，高级结构变化少，酶活力损失小，也适用于固定化细胞；缺点：酶与载体相互作用弱，酶易脱落；

4）通过离子键结合到水溶性载体上；优点：操作简单、条件温和、高级结构及活性中心不能被破坏，也适用于固定化细胞；缺点：载体与酶的结合力较弱，阴阳离子或阳离子缓冲液，离子浓度影响较大、酶较易从载体上脱落；

（二）化学结合法：

1）共价结合法：酶与载体共价结合；方法：将载体有关的基因活化，然后与酶有关的基因发生偶联反应，在载体结合比较牢固，一般不会固定底物浓度变化而改变；缺点：反应条件较激烈，往往会引起高级结构的变化，破坏活性中心，只适用于酶的固定化，不适用于细胞的固定化；

2）交联法：就使用多功能试剂或者是双功能试剂，使酶与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法，一般会通过降低交联剂浓度及反应时间保持酶活力；

（三）包埋法：

1）网格型：将酶或微生物包埋在高分子凝胶的细微网格中，此法是固定化微生物细胞用得较多的方法；优点：不需要与酶蛋白发生结合反应，酶活回收率较高；

2）微胶囊型：把酶分子包在一个胶囊中，高分子膜为半透型的，此胶囊不渗透，可以在一些无水的有机相中存在。

18.固定化酶的性质：

（一）固定化后酶活力的变化：

原因：1）酶分子在固定化过程中空间构象有所变化，甚至影响活性中心的氨基酸；

固定化后酶分子空间自由度受到，直接影响到活性中心对底物的空位作用；

内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻力；

包埋时，酶被高分子半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近；

固定化对酶稳定性的影响：

热稳定性提高；

2）对各种有机试剂及酶试剂稳定性提高；

3）对不同pH值的稳定性，对蛋白酶的稳定性，贮存稳定性和操作稳定性都有影响；

4）固定化酶稳定性提高的原因：固定化酶与载体可以多点连接，可以防止蛋白酶分子伸展变形；固定化后酶的活力可以缓解释放；可以抑制酶的自降解；

（三）最适温度变化----升高；

（四）最适pH值变化：范围扩宽；

（五）Km（米氏常数的变化的变化----变小，亲和力提高）。

19.固定化方法：

1）将辅酶和酶共同的固定在同一个载体上，可得到一个永久性不需外加辅酶的体系；

2）将辅酶直接固定在酶分子上。

20.细胞固定化：被自由移动的细胞，即细胞受到物理、化学等因素的约束或在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性，并且有能被反复连续使用的活力。

1.细胞固定化的优缺点：

优点：1）固定化细胞保持了细胞内酶系的原始状态和天然环境，因而更稳定；

保持胞内原有的多酶系统，对于多步催化优势更加明显，不需要辅酶再生；

对固定化增殖细胞发酵更具明显优势；固定化细胞密度大，可增殖，缩短发酵生产周期；发酵稳定性好，可较长时间的反复连续使用；发酵液中含的菌体较少有利于产品分离纯化，提高产品质量；

缺点：1）细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；

细胞膜、细胞壁，还有载体的存在都会形成一种扩散的作用；

3）载体形成的孔隙大小影响到高分子底物的通透性。

2.化学修饰：凡是通过化学基因的列入或除去而使蛋白质的共价结构发生改变，我们把这种现象称为化学修饰。

3.蛋白质功能基反应性影响因素：1）微区的极性：2）氢键效应；3）静电效应；4）位阻效应。

4.酶蛋白功能级的超反应性：指蛋白质的某个侧链基因与个别试剂能发生迅速反应。

5.影响超反应性的因素：1）改变蛋白质功能的pK值；2）蛋白质功能基具有较大的反应性；3）通过静电相互作用来吸引试剂并使其具有适当的取向；4）试剂与靠近修饰部位的蛋白区域之间的立体化学适应性。

6.修饰剂反应性的决定因素：1）选择吸附；2）静电相互作用；3）位阻因素；4）催化因素：5）微区极性（局部环境的极性）。

7.修饰反应专一性的控制：

（一）试剂的选择：

1）对氨基酸的修饰有几种情况：

a.修饰所有的氨基而不修饰其他基因；

b.反修饰α氨基；

c.修饰具有催化活性的氨基；d.改变蛋白质的带电状态和溶解性，改变蛋白质的带电状态要选择能够在中性条件下带最大电荷量的试剂，改变蛋白质的溶解性反应在水中进行，选择化学试剂为能溶于水的；3）反应产物的定量测定；4）考虑试剂的大小：选择试剂体积小一些，便于修饰，不致使蛋白质的构象发生较大变化；

反应条件的选择：

反应条件不会造成蛋白质的不可逆变性；

反应条件选择有利于专一性修饰蛋白质；

（三）反应的专一性：1）可以利用蛋白质中某些基因的特殊性；2）选择不同反应pH值；3）利用某些产物不稳定性；4）亲和标记；5）差别标记：在体系中有酶分子、底物、抑制剂存在时；6）利用蛋白状态的差异。

8.亲和试剂：也称作为位点专一性抑制剂，试剂作用于被作用位点的某一基因，而不与被作用部位以外的其他基因发生作用，这类修饰剂叫做亲和试剂。

9.亲和标记：亲和试剂一般都具有与底物相类似的结构，对酶的活性部位具有高度的亲和性，能对活性部位的氨基酸残基进行共价标记，把这一类专一性的化学修饰成为亲和标记，也称专一性不可逆抑制。

10.固定化酶：在一定空间上，呈闭合状态，可发生连续作用，最后回收再利用。

11.固定化是如何通过下列三种效应影响酶的稳定性：1）产生空间障碍；2）产生扩散；3）多点共价连接。

12.稳定化的方法：

（一）固定化（化学结合、包埋法等）：1）产生空间障碍：抑制化学失活；2）产生扩散：把酶包埋在多孔颗粒内部，底物先接触多孔颗粒表面，再扩散到内部与酶作用，

不受底物浓度控制；3）多点共价连接：将酶多点共价连接到载体表面，或用双功能试剂交联酶，或降酶包埋在载体紧密的孔中，可以使酶构象更加牢固，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过度。

13.核酶：是描述具有催化活性的RNA，其化学本质是核糖核酸具有酶的催化功能，底物可以是不同分子，也可以是同一RNA分子中的某些部位。

14.天然核酶：（一）剪切型核酶（催化自身和异体RNA的切割，核酸内切酶）：1）锤头型核酶；2）发卡型核酶；3）蛋白质—RNA复合酶；（二）剪接型核酶：包括组Ⅰ内含子和组Ⅱ内含子；实现RNA的自我剪接；具有核酸内切酶和连接酶的活性。

15.体外选择：从顺序随机的RNA或DNA分子构建的大容量随机分子库出发，在其中筛选得到极少数具有特异功能的分子。

16.适体：能与有机物或蛋白质等配体专一高效结合的RNA或DNA片段分别称RNA适体或DNA适体。

17.筛选适体的方案：1）化学合成DNA分子库，在分子链上的某一位置引入完全随机或部分突变的顺序，分子的两端是固定的顺序，以便PCR扩增；2）经过几轮PCR扩增后，体外转录形成一个具有随机顺序的RNA库；3）将这些RNA分子通过结合有靶分子的亲和层析柱，根据RNA与靶分子的结合能力大小将其区分开来，结合力强的RNA分子被最后洗脱下来；4）洗脱下来的RNA分子经过反转录、PCR扩增、转录，在进入下一次筛选循环，经过5~10个循环后，获得库中富集了与靶分子亲和力高的RNA分子。

18.核酶的筛选过程：1）通过转录随机序列的RNA构建一个DNA随机库；2）随机

库中具有催化活性分子可以催化底物与进行共价连接；3）将反应产物通过固定在底物RNA的5’端顺序互补配对的寡核苷酸亲和柱，选择性的吸附随机库中那些可以催化连接反应的RNA分子；4）经过高盐洗脱：逆转录、PCR扩增、转录、进入下一轮筛选；5）在接下来的筛选循环中，用易错PCR以一定频率向有活性的分子中引入突变，增加了筛选得到的随机库的分子多选择性；6）经过多轮筛选，有催化活性的RNA分子富集起来，而活性比较低的分子被淘汰。

19.脱氧核酶：利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段具有高效催化活性和结构识别能力。

1.体外选择方法：1）不需要转录和逆转录，人工合成DNA分子，直接进行PCR扩增；2）获得单链DNA分子：PCR扩增在引物上连接一个生物素，将PCR产物经过生物素蛋白的亲和柱来实现正负链的分离；3）引入二价的金属离子作为辅助因子；4）针对这些脱氧核酶，将一些额外功能团引入到DNA当中，来增加结构和功能的亲和性。

2.脱氧核酶的分类：（切割RNA的脱氧核酶）（切割DNA的脱氧核酶）（具有激酶活力的脱氧核酶）（连接酶功能的脱氧核苷酶）（催化卟啉环金属螯合反应）

3.反义核酸：DNA或RNA分子与mRNA分子结合，形成空间位阻，使其不能与核糖体结合，进而翻译成蛋白质另外也能降解mRNA。

4.酶分子的合理性设计：利用各种生物化学、晶体学、光谱学等方法对天然酶或其实突变性进行研究，获得酶分子特征。空间结构。结构和功能之间关系，以及氨基酸残基等方面的信息，然后以此为依据对酶进行改造。

5.酶分子的非合理性设计：不需要准确的酶分子结构信息，而通过随机突变、基因重组、空白筛选等方法对其进行改造，定向选择出所需要性质的突变酶。

6.酶分子定向进化：即酶分子的发展方向；是从一个或多个存在的亲本酶（天然的或人为获得的）出发，经过基因的突变或重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得领先期望的具有某些特性的进化酶。定向进化=随机突变+正向重组+选择（或筛选）。

7.易错PCR：在采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如提高Mg2+浓度，加入Mn离子，改变体系中dNTP的浓度等，改变Taq酶的突变频率，从而向目的基因中以一定的频率随机引入突变构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。

8.连续易错PCR：将一次PCR扩增得到的有用突变基因，作为下一次PCR扩增模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次后的的小突变累积而产生重要的有意突变。

9.DNA改组：将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起，形成新的突变基因库，又称有性PCR。

10.DNA改组的操作：从正突变基因库中分离出来的DNA片段用脱氧核糖核酸酶Ⅰ随机切割得到的随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，在PCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因片段之间的重组，将亲本中的有意突变进行重新组合。

11.交错延伸法：在PCR反应中，把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物，与体系内同时存在的不同模板退火，而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整长度的基因片段，结果

会产生间隔的含有不同模板序列的新生DNA分子，这样的新生DNA分子中，含有大量的突变组合，将有利于新的酶性质的产生。

12.基因文库：一个生物体的基因组DNA用性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有插入基因组DNA片段的载体分子集合体将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。

13.文库的代表性：指文库包含的DNA分子是否能完整地反映出来外源基因的全部可能的变化和改变，它是体现文库质量的最重要指标。文库代表性好坏衡量指标是文库的库容量。

14.库容量：指构建出的原始突变文库中所包含的的重组子克隆数。

15.构建突变库的载体：（λ噬菌体载体系统）（质粒载体系统）（哺乳类细胞表达载体系统）。

16.模拟酶：又称为人工酶或酶模型，在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征以及酶的作用机理和立体化学等特征的应用科学。

17.酶模型的（催化基团）和（底物之间）必须具有相互匹配的立体化学特征，这对形成良好的反应特异性和催化效力是相当重要的。

18.“主—客体”化学：主体（酶）和客体（底物）通过配位键和其他次级键形成稳定复合物的化学领域称为“主—客体”化学。

19.模拟酶的分类：（一）根据类型分：1）单纯酶模型；2）机理酶模型；3）单纯合

成的酶样化合物；（二）根据属性分：1）主—客体酶模型；2）胶束酶模型；3）肽酶；4）半合成酶；5）分子印迹酶；6）抗体酶。

20.抗体酶：抗体高度选择性和酶的高效催化能力巧妙的产物，本质是一类具有催化能力的免疫球蛋白，也叫催化抗体，专一性超过酶反应专一性催化速度，有的也可以达到酶的催化速度。

21.分子印迹：制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程，把化合物叫做印迹分子，也叫做模板分子。

22.分子印迹的原理（分子印迹的制备方法）：1）选择印迹分子的功能单体，使二者发生互补反应；2）在印迹分子----单体复合物周围发生聚合反应；3）用抽提法从聚合物中除掉印迹分子；4）形成的聚合物内保留与印迹分子形状、大小完全一样的空穴，该聚合物能以高选择性重新结合印迹分子。

23.表面分子印迹的种类：1）无机物为载体的表面分子印迹；2）固体材料表面修饰；3）蛋白质表面印迹。

24.生物印迹：分子印迹的一种，指以天然的生物材料（如蛋白质和糖类物质）为骨架，在其上进行分子印迹，而产生对印迹分子具有特异性识别空腔的过程。

25.生物印迹原理：生物分子构象的柔性在无水有机相中被取消，其构象被固定，因而模板分子与生物分子在水溶液中相互作用后产生的构象变化，在移入无水有机相中才能得以保持。

26.用生物印迹方法将蛋白质转化为半合成酶：1）使蛋白部分变性，扰乱起始蛋白的构象；2）加入印迹分子，使印迹分子与部分变形的蛋白充分结合；3）待印迹分子与蛋白质相互作用后，用交联剂交联印记的蛋白质；4）经透析方法除去印迹分子。