发酵吸附分离耦合生产乳酸链球菌素工艺

高分子材料科学与工程

POLYMERMATERIALSSCIENCEANDENGINEERING

Vol.26,No.10

Oct.2010

发酵吸附分离耦合生产乳酸链球菌素工艺

徐󰀁浩,吴兆亮,殷󰀁昊,阎󰀁瑾

(河北工业大学化工学院,天津300130)

摘要:为了解除微生物发酵过程中生物高分子乳酸链球菌素的抑制作用,提出发酵吸附分离耦合技术。在研究树脂对乳酸链球菌素吸附性能的基础上,研究了树脂及加入时间对发酵过程中细胞生长和乳酸链球菌素合成的影响。结果表明,D113对细胞生长影响很小,当发酵温度30󰀂,pH6󰀁25,在100mL发酵液中加入2g树脂,加入时间第5󰀁5h,发酵液中乳酸链球菌素的总效价是51IU/mL,与不加树脂的对照组相比,发酵吸附分离耦合技术使乳酸链球菌素效价提高了.9%。

关键词:乳酸链球菌素;发酵吸附分离耦合;离子交换树脂D113;吸附等温线

中图分类号:TB39󰀁󰀁󰀁文献标识码:A󰀁󰀁󰀁文章编号:1000󰀂7555(2010)10󰀂0155󰀂04

󰀁󰀁乳酸链球菌素亦称乳链菌肽(nisin),它是一种生物高分子,是由乳酸乳球菌产生的一种蛋白质[1],由34个氨基酸组成,通常以二聚体的形式存在。nisin是目前国际上允许商业化生产的最重要的天然食品防腐剂。根据近几年生产经验和相关文献报[5~7]道,微生物发酵生产nisin过程中,nisin对细胞生长特别是产物合成具有显著的抑制作用,从而了nisin产率的提高。因此解除这些抑制将大幅度提高nisin效价,降低生产成本,这就是发酵分离耦合技术。

PongtharangkuT等人[5]研究了微生物发酵与膜分离和吸附分离耦合生产nisin工艺,结果表明与非耦合工艺相比,耦合工艺使nisin效价从17IU/mL提高到7445IU/mL,效果非常显著,但是工艺复杂,分离成本较高,难以实现工业化生产。本文将吸附剂直接加入到发酵过程的发酵液中,在探索合适的吸附剂的基础上,研究吸附剂的加入时间对发酵和nisin吸附的影响,从而确定合适的生产工艺。1󰀁实验部分

1.1󰀁实验菌株和材料

生产菌株:乳酸乳球菌菌株,由天津康益生物工程有限公司提供;效价检测菌株:藤黄八叠球菌,从中国科学院微生物所菌种保藏中心购买;nisin标准品:美国Sigma公司生产;阳离子交换树脂D113、大孔树脂

[3,4]

[2]

NKA- :从南开大学化工厂购买。树脂的预处理方法见文献[8]。发酵工艺见文献[9]。1.2󰀁检测方法

根据文献[10]采用琼脂扩散法(ADT)定量分析nisin效价,根据文献[9]采用比浊法测定菌体生长曲线。

1.3󰀁树脂的选型及对nisin吸附的影响

对发酵吸附分离耦合过程所用的树脂最基本的要求是其不影响生长菌的生长和对目的产物有尽可能高的吸附量。根据nisin的理化性质和文献[8],本文初选阳离子交换树脂D113和大孔树脂NKA- 进行选型。本文在实验过程中,树脂经过预处理后直接用于实验,没有进行无菌处理,其原因一是nisin发酵整个周期不超过20h;二是发酵过程中产乳酸,特别是nisin抑制其它菌的生长;三是树脂是在nisin合成的对数期加入。

称量预处理好的上述两种干树脂各0󰀁5g置于100mL磨口三角瓶中,各加入30mLnisin处理后的发酵液(经过孔径0󰀁02󰀁m膜过滤后的发酵液),在温度30󰀂和pH6󰀁25的条件下吸附4h后,将达到吸附平衡后的发酵液和原发酵液分别进行效价检测,按式(1)计算吸附率。其中温度30󰀂和pH6󰀁25是由nisin发酵工艺所确定的,nisin发酵工艺见文献[9]。

收稿日期:2009󰀂11󰀂07

通讯联系人:吴兆亮,主要从事发酵工程和生物分离工程研究,󰀁E󰀂mail:zhaoliangwu@163.com

156高分子材料科学与工程2010年󰀁

通过吸附等温线表征吸附剂对nisin的吸附性能。配制不同效价的nisin发酵液,置于锥形瓶中,在30󰀂、pH6󰀁25的条件下进行摇床吸附,转速为130r/min,吸附4h达到吸附平衡。测定吸附平衡后发酵液中nisin的效价,按式(2)计算平衡吸附量Qe,确定吸附等温曲线。发酵液中nisin总的效价按式(3)计算。

(C0-Ce)

(1)

C0

(C0-Ce)V

󰀁󰀁󰀁Qe=(2)

W

Qe!W

󰀁󰀁󰀁C=Ce+(3)

V

式中:C∀∀∀发酵液中nisin总的效价(IU/mL);󰀁󰀁󰀁E=

C0和Ce∀∀∀初始发酵液和吸附后的发酵液中nisin的效价(IU/mL);Qe∀∀∀nisin平衡吸附量(IU/g);V∀∀∀发酵液体积(mL);W∀∀∀加入树脂的质量(g)。1.4󰀁吸附剂对发酵的影响

王晖等[11]采用树脂与发酵液以1#30比例(体积比)进行树脂的选型,考虑到树脂密度等理化性质,本文取2󰀁00g树脂加入到100mL发酵培养基中进行发酵分离耦合实验。由于对数生长中期菌体已经大量生长,因此选择在对数生长中后期加入树脂。将菌种接种于每瓶100mL的发酵培养基中,接种量为5%,其中一组在接种后第5h加入2󰀁00g树脂作为发酵吸附分离耦合的实验组,而另外一组不加树脂作为对照组,发酵工艺及培养基配方见文献[9],根据1.2节分别测定两组的细胞生长曲线。在确定吸附剂无毒害作用的基础上,研究树脂的加入时间对nisin发酵和效价的影响:先测定对照组nisin合成曲线,根据对照组的细胞生长曲线和产物合成曲线,在此曲线的对数中后期每隔1h向发酵液加入2󰀁00g树脂,达到发酵终点进行效价测定。

1.5󰀁合适发酵吸附分离耦合工艺确定试验

取扩大培养后的菌种接种于4瓶100mL的发酵培养基中,在30󰀂、pH6󰀁25的条件下进行发酵,同时进行两组对照实验,其中两瓶在接种后第5h加入2󰀁00g树脂作为发酵吸附分离耦合的实验组,而另外两瓶不加树脂作为对照组,分别测定两组所能得到的nisin总的效价。2󰀁结果与讨论2.1󰀁树脂的选型

两种树脂对发酵液中nisin的吸附能力如Tab.1所示,离子交换树脂D113对发酵液中nisin的吸附性能较大孔树脂NKA󰀂 好,这是因为D113树脂是一种大孔型弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂,在其交联丙烯酸骨架中含有羧酸功能基团,因而能够与nisin表面的氨基结合而被吸附,故选取D113进行发酵吸附分离耦合实验。

Tab.1󰀁Adsorptionratesofdifferentresins

ResinstypeAdsorptionrate(%)

D11387.00

NKA󰀂 53.

2.2󰀁树脂吸附nisin的性能

按照1.3节确定离子交换树脂D113的吸附等温线(见Fig.1),并对此吸附等温线进行拟合(见Fig.2),结果表明,D113在30󰀂符合Langmuir吸附平衡关系式。

Fig.1󰀁AdsorptionisothermofD113

Fig.2󰀁FitlinearofLangmuirisotherm

󰀁󰀁D113拟合后的线性方程为1/Qe=0󰀁017/Ce+2󰀁3!10-6,线性相关系数R=0󰀁995。

2.3󰀁吸附剂对细胞生长的影响

分别测定对照组和发酵分离耦合组的菌体生长曲线,结果如Fig.3所示。

由Fig.3可知,两组曲线趋势相同,在稳定期对照组和发酵分离耦合组的OD最高分别为0󰀁737和0󰀁706,相对误差为4.2%,在细胞生长影响允许范围内,D113的加入对菌体生长影响很小,因此表明D113的加入没有对细胞造成明显的破环。其原因一是发酵过程是厌氧过程,无需高的搅拌转速,D113对细胞的

󰀁第10期徐󰀁浩等:发酵吸附分离耦合生产乳酸链球菌素工艺157

碰撞影响小;二是由于D113吸附发酵液中有效组分少,所以D113是合适的吸附剂,为发酵吸附分离耦合的进一步研究奠定了基础。

mL,实验组nisin的总效价为51IU/mL,与对照组相比,试验组效价提高了.9%。3󰀁结论

D113树脂是发酵吸附分离耦合过程合适的吸附剂,当发酵温度30󰀂,pH6󰀁25,发酵第5h时,2g树脂加入到100mL发酵液中,与对照组相比,细胞生长减小仅4.2%,对细胞生长影响很小。D113树脂在发酵液中吸附nisin符合Langmuir吸附平衡关系式。合适的发酵吸附分离耦合生产nisin工艺是发酵温度30󰀂、pH6.25,接种量5%,在100mL发酵液中,发酵第5󰀁5h时加入2g树脂。发酵终点时对照组

󰀁󰀁󰀁󰀁Fig.3󰀁Thecontrastofthetwogrowthcurves

∃:thefermentationcoupledwithseparationgroup;%:thecontrolgroup

nisin效价为3350IU/mL,实验组nisin的总效价为51IU/mL,与对照组相比,试验组效价提高了.9%。

参考文献:

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8.5

2.4󰀁吸附剂加入时间对nisin效价的影响

Fig.3和Fig.4表明,从发酵第3个小时起,菌体进入对数生长期,nisin大量合成,考虑到此时期菌体生长代谢旺盛,抗不良环境的能力强,因此选择在对数期加入树脂,即分别在发酵开始后的第4󰀁5h、5󰀁5h、6󰀁5h、7󰀁5h、8󰀁5h依次加入2󰀁00gD113进行平行对照实验,结果如Tab.2所示。

Tab.2󰀁Effectofaddingtimeonnisin&stiter

Addingtimeoftheresin(h)Totaltiterofthebroth(IU/mL)

4.5

5.5

6.5

7.5

[5]󰀁PONGTHARANGKUT,DEMIRCA.Onlinerecoveryofnisin

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󰀁󰀁Tab.2表明,在发酵进行至第5󰀁5h时加入D113最合适,在此之前加入,细胞生长刚进入对数生长期,树脂的加入一定程度上影响细胞生长,从而影响nisin的产率。而在此之后加入,产物抑制已经在一定程度上形成,从而导致nisin产率也偏低。2.5󰀁合适发酵吸附分离耦合工艺确定

根据以上研究,合适的发酵吸附分离耦合生产nisin工艺为发酵温度30󰀂,pH6󰀁25,接种量5%(体积分数),在100mL发酵液中,发酵第5.5h时加入2g树脂。发酵终点时对照组nisin效价为3350IU/158高分子材料科学与工程2010年󰀁

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TechnologyofFermentationCoupledwithAdsorptionSeparationforNisinProduction

XUHao,WUZhao󰀂liang,YinHao,YANJin

(SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,HebeiUniversityofTechnology,Tianjin300130,China)ABSTRACT:Thetechnologyoffermentationcoupledwithadsorptionseparationwasputforwardinordertorelievetheinhibitionofbiomacromoleculesnisinintheprocessoffermentation.Theeffectsofresinandadditiontimetocellgrowthandnisinsynthesisintheprocesswerestudiedonthebasisoftheresearchonresin∋sadsorptioncapabilityto

nisin.TheresultsshowthatD113hasfeweffectstocellgrowth.Whenthesuitabletechnologyisfermentationtem󰀂perature30󰀂,pH6󰀁25,resin2gtobeaddedtothefermentationbroth100mLandadditiontime5󰀁5h,thetotaltiterofnisinis51IU/mL.Thetechnologyoffermentationcoupledwithadsorptionseparationhasincreasedthetiterofnisinby.9%incontrastwiththegroupwithoutaddtheresin.

Keywords:nisin;fermentationcoupledwithadsorptionseparation;ionexchangeresinD113;adsorptionisotherm

(上接第1页。continuedfromp.1)

ThePreparationandCharacterizationofPolymerBrushontheSurfaceofGlass

CHENZhi󰀂jun,WEIYong󰀂hao,ZHUHai󰀂yan,YANGQing󰀂xiang,LIDing󰀂ding(CollegeofChemicalEngineeringandMaterialsScience,ZhengzhouUniversity

ofLightIndustry,Zhengzhou450002,China)

ABSTRACT:Here,abrush󰀂likepolystyrene(PS)wassynthesizedonthesurfaceoftheglassbyusinglivingin󰀂situgraftingpolymerization.First,the3󰀂methacryloxypropyltrimethoxy󰀂silane(3󰀂MPS)wasgraftedontothesurfaceoftheglasstoformterminalvinylgroupsasgraftingsites;then,inthepresenceofbenzoylperoxide(BPO)and4󰀂hy󰀂droxyl󰀂2,2,6,6󰀂tetramethyl󰀂1󰀂piperidinyloxy(HTEMPO(),brush󰀂likepolystyrene(PS)withthethicknessof4nmto28nmwassynthesizedontothesurfaceoftheglassviathegrowthofPSchainsfromthesurfaceofthe3󰀂MPSinitiatorlayer.X󰀂rayphotoelectronspecroscopy(XPS)showsthatthepeakat99eVSi(2p),151eVSi(1s)and533eVO(1s)decreaseswithincreasingreactiontime,thatpeakat285eVC(1s)increaseswithincreasingreactiontime.Thethicknessofpolystyrenechangesfrom4nmto28nmwithincreasingreactiontime.Fouriertransformin󰀂fraredspectrum(FT󰀂IR)showsthatthepolystyreneiscovalentlyanchoredontothesurfaceofglass.Keywords:livingin󰀂situpolymerization;polystyrene;polymerbrush