发酵实验报告(根霉曲的制备及根曲霉糖活力的测定)

本科学生实验报告

本科学生实验报告

学号 104120440 姓 名 孙 永 升 学院 生命科学学院 专业、班级 10生物技术 实验课程名称 发 酵 工 程 学 < 实 验 > 教师及职称 唐 湘 华 < 讲 师 >

开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期 填报时间 2013 年 4 月 3 日

云南师范大学教务处编印

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实验名称 实验一、 根霉曲的制备及根曲霉糖化力的测定 1、 实验目的 1.1掌握固体发酵的基本操作步骤； 1.2了解根霉曲制作工艺和基本原理； 1.3了解糖化酶的测定方法； 1.4对糖化酶的糖化产物及糖化DE的计算； 1.5了解根霉曲在发酵生产过程中主要应用依据。 实验方式 小组成员 XX XX XX XX 小组合作 2、 实验设备及材料 2.1材料：麦麸、 根霉AS3.866 2.2试剂：柠檬酸缓冲液、DNS、1%淀粉 2.3用具：电子天平、烧杯、三角瓶、纱布、报纸、移液、水浴锅、离心机、722U分光光度计、磁力搅拌器、高压灭菌锅、超净工作台、培养箱、研钵 3、实验原理及实验流程或装置示意图： 3.1根霉曲的制备原理： 通过固体发酵，根霉在麦麸培养基中进行大量繁殖，产生淀粉酶和糖化酶复合酶系；通过淀粉酶的液化和糖化酶的糖化作用将淀粉转化为还原单糖。 3.2根曲霉糖化力的测定原理： 淀粉是由葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直、链淀粉和α-1,6位有分支的支链淀粉组成的，直链淀粉约含100-6000个葡萄糖单位，支链淀粉平均含6000个以上的葡萄糖单位，最高可达300万;淀粉酶首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖；通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降低为还原性的单糖。

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3.3固体发酵一般流程如下： 保藏菌种 原料 ↓ ↓ 斜面活化 预处理 ↓ ↓ 固体三角瓶培养 蒸料 ↓ ↓ 固体浅盘培养 冷却 接种 培养 4、实验方法步骤及注意事项： 4.1根霉曲的制备步骤： 4.1.1培养基的配制与灭菌（约60%含水量） → 放入烧杯拌匀（以组为单位）→ 分装于三角瓶

→包上纱布（至少6层） → 包报纸4层 → 包 扎→ 120℃灭菌1h→ 摇动打散瓶内培养基→冷却至约30℃ 麦麸20g＋20ml水 /人 4.1.2接种（ AS3.866 ） 液体接种，接种量5%→无菌操作进行接种（在超净工作台中进行）→摇匀 →包扎→ 在瓶壁上写上姓名、接种日期。 4.1.3培养 接种后的三角瓶倾斜平放出料（烘干、磨碎） 4.2根曲霉糖化力的测定步骤：

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→28℃培养24h → 扣瓶 →继续培养约24~48h →→根霉曲

4.2.1绘制标准曲线的方法 4.2.1.1先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。 4.2.1.2浓度c为横坐标，OD为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。 4.2.1.3然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。 4.2.1.5 0.1%葡萄糖标准曲线的制作： 取7支试管，编号，按照下表进行操作：如表一所示 试管编号 葡萄糖溶液 体积（ml） 葡萄糖含量 （mg） 缓冲液（ml） DNS (ml) 定容总体积(ml) OD（0nm） 0 0.0 1 0.2 2 0.4 3 0.6 4 0.8 5 1.0 0.0 2.0 3 15 0.2 1.8 3 15 0.4 1.6 3 15 0.6 1.4 3 15 0.8 1.2 3 15 1.0 1.0 3 15 （葡萄糖标准贮备溶液的浓度为1mg/ml。） 表一 4.2.2酶液的制备 将小块状的根霉曲用研钵研碎，取2克根霉曲溶解到20毫升缓冲液中，混合搅 拌10分钟，离心取上清液液备用。 4.2.3糖化酶酶活测定 糖化酶酶活力的定义： 1毫升酶液在55℃，pH6.0的条件下，每分钟水解可溶性

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淀粉产生1umol葡萄糖的酶量为1个酶活力单位（U）（国标法糖化酶活力单位定义）。 酶活力单位（U/ml）= {[K(ODA + ODB )]/2 + b}×N×103 /10/0.2/180.2 式中： ODA——A管的吸收光度值； 103——mg转换为ug； ODB——B管的吸收光度值； 180.2——葡萄糖的摩尔质量； N——酶液的稀释倍数； 10——表示酶反应时间为10min； K：标准曲线斜率。 取酶液按照下表要求操作测定酶活：如表二所示 操作步骤 步骤1 步骤2 步骤3 步骤4 步骤5 步骤6 步骤7 沸水浴煮沸5min 步骤8 步骤9 流水冷却 加蒸馏水10mL，混匀 流水冷却 加蒸馏水10mL，混匀 OD0nm比色 流水冷却 加蒸馏水10mL，混匀 OD0nm比色 空白管 样品管A 样品管B 吸取1.8mL淀粉底物溶液 吸取1.8mL淀粉底物溶液 吸取1.8mL淀粉底物溶液 50℃保温5分钟 —— 50℃精确保温10min 50℃保温5分钟 加入待测酶液0.2毫升 50℃精确保温10min 50℃保温5分钟 加入待测酶液0.2毫升 50℃精确保温10min 加入3mLDNS试剂终止反应 加入3mLDNS试剂终止反应 加入3mLDNS试剂终止反应 混合均匀 加入0.2毫升待测酶液， 沸水浴煮沸5min 沸水浴煮沸5min 混合均匀 混合均匀 步骤10 OD0nm比色 （注意：OD =（A+B）/ 2，比色前根据具体情况稀释相应的倍数。） 表二 4.2.4淀粉酶的液化效果试验 取一只试管装入1毫升1%浓度的淀粉底物，50℃预热5分钟，加入酶液1毫升，反 应5分钟，取5毫升稀碘液检测淀粉显色情况。 5

4.2.5酶活测定注意事项 4.2.5.1试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落； 4.2.5.2移液的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换头。 4.2.5.3精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理； 4.2.5.4避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时； 5 实验处理 5.1实验现象、数据及观察结果 5.1.1根霉曲的制备： 接种24小时后，看到三角瓶壁和麦麸之间有灰白色小绒毛状物，白色小绒毛状物比较集中在一个区域。扣瓶 24 小时后烘干时成灰黑色的小块状根霉曲， 5.1.2标准曲线的测量结果：如表三 试管编号 OD（0nm）值 0 — 1 0.0595 2 0.2135 3 0.345 4 0.493 5 0.622 表三 5.1.3糖化酶活力测定现象及结果：如表四 试管号 颜色 OD0nm 空白管 浅棕色 0.00 表四 样品管A 样品管B 棕黄色 0.0 棕黄色 0.517 6

5.2对实验现象、数据及观察结果的分析与讨论： 5.2.1葡萄糖标准曲线 葡萄糖标准曲线0.70.6y = 0.7023x - 0.0747R2 = 0.9992OD0nm值0.50.40.30.20.1000.20.40.60.811.2系列1线性 (系列1)葡萄糖浓度(mg/ml) 图1 标准曲线 葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程y=kx-0.0747，k=0.7023， R2=0.9992>0.99，该标准曲线相关性很好。式中Y表示表示测定的吸光度（OD）值，X表示还原糖的浓度, 0.0747表示补偿参数。 5.2.2糖化酶活测定结果 酶活力单位（U/ml）= {[K(ODA + ODB )]/2 + b}×N×103 /10/0.2/180.2 =1.6737U/ml 实验结果测得根曲霉糖化力为1.6737U/ml。 5. 2.3淀粉酶的液化效果试验 当向加酶液的试管加入碘液时，试管中溶液没有颜色的变化，而相反的是没有加酶液的试管中溶液变成了蓝色。说明淀粉酶将底物淀粉还原成了糖类，所以当加入碘液的时候，溶液没有颜色变化；颜色变蓝的试管说明溶液中的底物还能与碘溶液发生反应。 5. 2.4分析与讨论 与大多文献论文实验结果相比较我们的所测得的根曲霉活偏低。原因如下：

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1、根据酶的特点其活性受温度、pH、反应体系溶液的离子强度、酶浓度、底物、反应时间等各种因素综合作用都会影响糖化酶活力的测定结果，本次试验只是简单地验证性实验测定。要更加准确测定糖化酶活需要我们减少或控制其他变量，只针对单一变量操作，这些有待进一步实验。 2、糖化酶是诱导酶。淀粉能诱导酶的形成，培养基中淀粉浓度与糖化酶的酶活及糖化酶的mRNA 含量成正相关，在培养基中适当提高培养基中淀粉含量，可以 增加产酶的量，酶活也有所提高。本实验没有添加任何诱导物。 3、实验人员的在吸取、滴定等操作存在误差，导致实验结果有所偏差。 4、制备5%固体曲浸出液时，糖化酶没有完全浸出，造成分解淀粉量减少，滴定所用标准葡萄糖溶液增多，计算所得酶活力减少。 6、实验小结 本次实验成败之处及其原因分析： (1)、熟悉根酶曲的简单制作，加强实验动手能力，小组合作意识。 (2)、通过根酶曲的制作及酶活力的简单测定，加强了“无菌”操作的概念，了解根酶曲糖化活力测定的原理，掌握了酶活力的测定方法与酶活单位的定义、意义。 (3)、由于酶的反应特殊性与复杂综合因素影响因此在酶活力测定过程中，为了减少误差，应该熟悉掌握操作过程，对影响到的诸多因素严格控制，如：对温度严格控制，为了减少视觉误差造成的影响，还可进行实验预滴定。 改进措施： (1)、测酶活时严格控制影响到的因素，如反应温度、时间、pH等。 量取液体时精确，如缓冲液、酶液。 (2)、对反应后的实验结果做好记录。

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7、实验思考题 (1) 糖化酶对淀粉的作用情况？ 答：糖化酶对淀粉作用点： 糖化酶(葡萄糖淀粉酶)对淀粉的水解作用是从淀粉的非还原性末端开始，依次水解α一1，4葡萄糖苷键，顺次切下每个葡萄糖单位，生成葡萄糖。葡萄糖淀粉酶专一性差，除水解α一1，4葡萄糖苷键外，还能水解α一1，6键和α一1，3键，但后两种键的水解速度较慢，由于该酶作用于淀粉糊时，糖液黏度下降较慢，还原能力上升很快，所以又称糖化酶，不同微生物来源的糖化酶对淀粉的水解能力也有较大区别。 (2)、酶活力测定实验的总体设计思路是什么？实验设计的关键是什么？为什么？ 答：利用酶的专一性或酶活力的影响因素抑制除待测酶以外的其它酶活性，通过测酶促反应的产率推算酶活力大小。关键在于抑制其它酶的活力而不影响测定酶，这样可以减小或避免其它酶产物给测定结果带来的误差。 (3)、本实验中所设置的对照管的作用？它与比色法测定物质含量实验中设置的空白管有何异同？ 答：用来校正糖化酶本身与可溶性淀粉中还原性物质与消除非酶促反应（如淀粉酸性环境下加热水解）和非测定时间内的酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差。两种都是为了消除非测定部分对光的吸收，空白组是为了消除溶液中溶剂等其它组分对光的吸收，而对照管是为了消除非测量所需反应所得的多余溶质对光的吸收。 (4)、糖化酶的测定中影响因素？ ①空白对测定结果的影响：空白的制备原则是使糖化酶不催化分解可溶性淀粉, 即反应液中不存在葡萄糖。 ②酶液稀释倍数对测定结果的影晌：在制备待测酶液时, 稀释倍数不同对测定结果有较大影响。 ③糖化时间长短对测定结果的影响。 ④试剂加入顺序对测定结果的影响。 ⑤酶制备液存放时间长短对测定结果的影响：试验是指从向酶中加缓冲液开始至糖化反应开始这段时间的长短对测定结果的影响。据试验, 该酶在缓冲液中是非常稳定的。从半小时后开始测定酶活力, 间隔一定的时间连续测定, 直到存放三天后为止,结果测得酶活力基本一致, 并没有因存放时间延长而活力下降。

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7 参考文献： [1] 林雪琴.影响糖化酶活力测定的因素[J].发酵科技邀讯，1993，2(22):24~27. [2] 武金霞. 糖化酶的研究进展及趋势[J].自然杂志, 2002, 25(3):161-163. [3] 冯涛. 酶活力测定的方法及其影响因素[J].中国饲料, 2003，18:32~33. [4] 马永强等. 玉米萌发过程中淀粉酶性质的研究[J]. 食品科学, 2007,11 (28)294~297. [5]单海艳.黑曲霉生产糖化酶及酶活测定[J].牡丹江大学学报, 2010,7(19):92~94. [6] 梁新红,孙俊良,唐玉,郭祖峰. 黑曲霉糖化酶分离纯化与酶学性质研究[J]. 河南科技学院学报, 2011,4(39):24~27. [7] 孔维锐，郭福宗，周胜，寸跃芳，唐湘华. 产糖化酶根霉的分离以及酶学性质的初步研究[J]. 酿酒科技，2012，9(1):32~35. 指导老师评语及得分： 签名： 2013年 04月 日

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