间接ELISA法测定抗人白蛋白效价 (2)

间接ELISA法测定抗人白蛋白效价

摘要：目的 我们通过运用间接ELISA法，来测定羊抗人白蛋白的效价。方法 在以往的实验中，我们大多运用的是ELISA法来测定，这次，我们运用的是间接ELISA法。结果在包被的人ALB浓度为0.1~0.01ug/ml时，测出的抗人ALB的效价为1：10240。结论 运用间接ELISA法，在检测抗人ALB的灵敏度高，优化了反应条件，可用于初步抗人ALB的检测。

【关键词】间接ELISA法 抗人白蛋白 效价

间接ELISA法，是目前最常用的方法，因其灵敏度高，操作简便而被运用广泛。此方法是测定抗体最常用的方法，属于非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。此次试验就是用间接ELISA测定未知的抗人ALB的效价。 1.材料与方法 1.1 试剂

0.1M PH7.4 PBS缓冲液、洗涤液:0.05%Tween-PBS、1%酪蛋白溶液、硫酸溶液（学校实验室提供）、人ALB（SIGMA:A1653 SIZE:250MG storage:2-8℃）、羊抗人ALB（效价1:70 批号：201106 贮存于4-20℃，有效期：2年）、显色液（A液、B液Cat:ME002 可溶性TMB显色液)、酶标抗体（兔抗羊--HRP，武汉博士德生物工程有限公司） 1.2器材

塑料试管、微孔反应板、封片纸、试管架（学校实验室提供）、移液器（上海荣泰生化工程有限公司；Thermo移液器）、洗板机（BIO-RADMODEL1575Immunowash）、SM-3自动化酶免分析仪（北京天石医疗用品制作所）、电热恒温培养箱（上海恒科学仪器有限公司） 1.3原理与方法

包被抗原

↓温育洗涤3次 加封闭液

↓温育洗涤3次 加入标本

↓温育洗涤5次 加入酶标记抗体 ↓温育洗涤5次 加入底物 ↓温育 加入终止液 ↓ 检测

1.3.1确定包被的抗原及兔抗羊IgG-HPR的工作浓度，首先从大范围对人ALB包被浓度及羊抗人IgG-HPR的浓度进行探索，即人ALB:0.01ug/ml、0.1ug/ml、1.0ug/ml、10.0ug/ml，羊抗人IgG-HRP:1：500、1：2000、1:8000:、1:32000，按下表进行操作，根据大范围检测初步确定人ALB包被浓度及羊抗人IgG-HRP的大致工作浓度。

人ALB：10ug/ml 人ALB：1ug/ml 人ALB:0.1ug/ml 人ALB0.01ug/ml ：

1.3.2确定抗人ALB所需的反应体系 一抗 二抗 1：8000 1：10 1：20 1：40 1：80 1：160 1：320 1：0 PBS 1：1：1：1：1280 2560 5120 10240 1： 16000 1： 32000 1.3.3操作步骤

包板：将包被抗原用碳酸盐缓冲液稀释到0.01-10ug/ml，于微孔反应板中加入100ul/孔，4℃过夜后弃孔内液体，用洗涤液洗板5次。

封闭：加入300ul 1%酪蛋白溶液，4℃过夜弃孔内液体，用洗涤液洗板5次。

加入一抗：用PBS将待测血清稀释成不同的倍数，按上图加入待测血清浓度100ul/孔，37℃孵育1h，洗板5次。

加酶标二抗：每孔加入100ul/孔，混合，37℃孵育30min，洗板5次。

加底物：每孔加入显色液A 50ul/孔，显色液B 50ul/孔，混匀，孵育15min。 终止反应：每孔加入100ul终止液，混匀，终止反应。

测OD值：在1h内，用酶标仪测450nm波长处OD值（参比波长630nm）。 1.4计算

各样品OD值，比上空白对照的OD值即为ROD值，ROD值大于等于2.1即为阳性，

此稀释度即为该标本的效价。 2.结果

2.1确定的抗原和兔抗羊IgG-HRP的工作浓度

在所有的包被抗原的浓度中，人ALB的浓度为0.1ug/ml，0.01ug/ml，数据的梯度和空白对照的数据最好，数据如下表1、表2。 2.2羊抗人ALB的效价的确

根据测定的OD值与空白值的比大于2.1中，稀释浓度最高的即为最高效价，应为1：10240，数据见下表3、表4。 1：500 1：2000 1：8000 1：32000

1：20 2.443 3.325 2.170 0.783

1：40 2.476 3.268 1.926 0.698

1：80 0.209 0.202 0.030 0.023

1：160 2.2 2.166 1.103 0.368

1：320 1.451 1.224 0.665 0.140

PBS 0.938 0.343 0.041 0.060

包被的人ALB抗原浓度为0.1ug/ml

表1

1:500 1:2000 1:8000 1:32000

1:20 2.515 2.407 1.838 0.823

1:40 2.262 2.709 2.312 0.946

1:80 2.206 2.719 1.750 0.431

1:160 2.435 2.298 1.079 0.432

1:0 1.757 1.522 0.665 0.124

PBS 0.783 0.258 0.030 0.022

包被的人ALB抗原浓度为0.01ug/ml

表2

111

：：：

1：10 1：20 1：40 1：80 1：

160

1.956 1.486 1.919

2.432 2.111 1.655 1.855 1.617 1.858

1.919 1.691 1.702

1.938 1.532 1.414

8000

1.6 1.746

1.487 1.509

1.0 1.242

1.788 0.875

1.083 0.669

1.432 0.492

0.5 0.0

16000 32000

1：320 2.459

1：0 2.178

1：1280 1.8

1：2560 1.988

1：5120 1.7

1

：

PBS 0.720

10240 1.720

包被抗原为0.01ug/ml时的OD值

表3

111

：：：

1：10 1：20 1：40 1：80 1：

160

2.367 1.985 1.517

2.0 1.771 1.2

2.080 1.569 1.657

1.736 1.852 1.6

1.783 1.818 1.232

8000

1.683 1.639

1.521 1.482

1.660 1.465

1.384 1.167

1.336 1.081

1.044 1.096

0.143 0.285

16000 32000

1：320 1.678

1：0 1.720

1：1280 1.724

1：2560 1.751

1：5120 1.695

1

：

PBS 0.208

10240 1.187

包被抗原为0.1ug/ml时的OD值

表4

3.讨论

实验是采用间接ELISA法先确定了人ALB、兔抗羊-HRP的工作浓度，然后确定抗人ALB的效价。间接ELISA法是利用酶标记的抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体.其步骤是将一抗羊抗人加入到包被的抗原里，使其特异性的结合，然后洗涤剩余的游离的一抗，再加入二抗兔抗羊予微此孔计数板里，结合形成抗原—羊抗人—兔抗羊复合物，然后用酶标仪测出OD值，再计算出空白值，根据样品的OD值与空白值的之比，若大于2.1则为阳性，若小于2.1则为阴性。

在实验中，因无阴性对照和阳性对照，我们只有借鉴空白对照为阴性对照，所以在结果的计算中，会有一定的差异和误差。在封闭抗原的过程中，曾因未及时把包被的抗原取出，导致了结果的失败。在上表的结果分别为在测定后所确定的最佳的浓度的数据，在确定抗人ALB效价过程中，因包被的板在保存过程中受到了一定的污染，所以重复做了一次确定抗人ALB效价的实验。因此，在之后的实验中，我们要在实验过程中，要及时的掌握好实验的时间和保存方法，以免影响到实验的结果。 4.结论

通过间接ELISA法，我们确定了最佳抗原的工作浓度为0.01~0.1ug/ml,抗人ALB的效价为1:10240。但在我们计算的数据中，最高的稀释浓度的比值都远远大于2.1，且没有小于2.1的数据，所以，我们的抗体的稀释浓度还不够，所以我们还可以对抗人ALB继续稀释的梯度间隔缩小。