一种新的基因敲除术_RNAi

・技术与方法・ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ

２００６年第３期一种新的基因敲除术－ ＲＮＡｉ

李颖平１

（

１

张映１邵国青２

２１００１４）

山西农业大学，太谷０３０８０１；２江苏农业科学院，南京

摘要：简便的方法，ＲＮＡｉ主要通过ｄｓＲ－ＲＮＡｉ作为关闭特定的基因新技术，为基因功能研究提供了一个快速、

ＮＡ被核酸切割成２１￣２５ｎｔ的干扰小ＲＮＡ即ｓｉＲＮＡ，由ｓｉＲＮＡ介导的识别并切割同源性靶ｍＲＮＡ分子而实现。ＲＮＡｉ

是新发现的一种通过ｄｓＲＮＡ特异性高效抑制基因表达途径。在随后的短短几年中，ＲＮＡｉ现象被发现存在于大多数真核生物中，这种存在揭示了ＲＮＡｉ可能是出现于生命进化的早期阶段［１］。

关键词：

ＲＮＡｉ分子机制应用及前景

ＡＮｅｗＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｏＤｅｌｅｔｅＧｅｎｅ－ＲＮＡｉ

ＬｉＹｉｎｇｐｉｎｇ１ＺｈａｎｇＹｉｎｇ１ＳｈａｏＧｕｏｑｉｎｇ２

（１ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ０３０８０１；２ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆＳｃｉｅｎｃｅｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅｉｎＪｉａｎｇＳｕｐｒｏｖｉｎｃｅ，ＮａｎＪｉｎｇ２１００１４）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：

ＲＮＡｉｉｓｒｅｇａｒｄｅｄａｓａｎｅｗｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｃｌｏｓｉｎｇｓｐｅｃｉａｌｇｅｎｅｓ，ｗｈｉｃｈｏｆｆｅｒｓａｓｉｍｐｌｅａｎｄｑｕｉｃｋｗａｙ

ｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｇｅｎｅｔｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＲｎａｉｉｓａｃｈｉｅｖｅｄｍａｉｎｌｙｂｙｄｓＲＮＡｃｕｔｔｅｄｉｎｔｏ２１￣２５ｎｔｓｍａｌｌＲＮＡｊｕｓｔａｓｓｉＲＮＡ，ｂｙｗｈｉｃｈｍｅｄｉａｔｅａｎｄｒｅｃｏｇｎｉｚｅｈｏｌｍｏｌｏｇｏｕｓｇｏａｌｍＲＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅ．ＲＮＡｉｉｓａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｒｅｓｅｎｔｌｙｆｏｕｎｄｂｙｄｓＲＮＡ，ｗｈｉｃｈｓｐｅｃｉａｌｌｙｈｏｌｄｄｏｗｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［１］．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＲＮＡｉｍｏｌｅｃｕｌｅＭｅｃｈａｎｉｓｍ

Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔ

ＲＮＡｉ现象大致可分为三种，其作用机制大致

相同，不同的研究小组对它的命名不同。植物学家称之为共抑制，菌类学家称之为静息作用，昆虫学家和动物学家称之为ＲＮＡｉ。ＲＮＡｉ在维持基因稳定、保护基因组免受外源核酸侵入、基因表达等方面发挥重要生物学作用。ＲＮＡｉ作为基因沉默的一个工具，已被广泛用于基因功能的研究、基因治疗和新药研究与开发等方面［２］。

Ｍａｃｉｎｏ和Ｃｏｎｇｏｉ发现将合成类胡萝卜所需的基因

导入粗糟红色链孢霉，导致３０％的转化细胞中霉菌本身的基因失活，并将其称之为基因的静息作用。

１９９５年，康乃尔大学的ＳｕＧｕｏ博士在试图阻断秀丽

新小杆线虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）中的ｐａｌ－１基因时，发现了一个意想不到的结果，他们本想利用反意ＲＮＡ技术特异性地阻断上述基因的表达，同时在对照实验中给线虫注射正义ＲＮＡ（ｓｅｎｓｅＲＮＡ）以期观查到基因表达的增强，但达到的结果是二者都同样地切断了ｐａｌ－１基因的表达途径，这是与传统上反义ＲＮＡ技术的解释正好相反的。直到１９９８年２月，华盛顿卡耐基研究院的ＡｎｄｒｅｗＦｉｒｅ和马萨诸塞大学医学院的ＣｒａｉｇＭｅｌｌｏ才首次揭开这个谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，ＳｕＧｕｏ博士遇到的正义ＲＮＡ抑制基因表达的现象，以及过去的反义ＲＮＡ技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得ＲＮＡ中污染了微量双链ＲＮＡ而引起。

当他们将体外转录得到的单链ＲＮＡ纯化后注

１ＲＮＡｉ的发展史

ＲＮＡｉ首先是在１９９０年由Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等人在研

究矮牵牛花中发现的一种转基因同时抑制自身和相应内源基因表达的基因沉默现象。他们本欲通过加入外源色素合成基因拷贝而产生出更深的紫色牵牛花，但是实验并为达到预期的结果，有的转基因植物开出全白或部分白的花，这表明色素的合成不是被加强而是被抑制。事实上，不仅导入的基因没有表达，植物自身的色素合成基因的表达也失活了，这种现象被称为基因的工抑制现象。１９９４年，

收稿日期：２００６－０３－１３

作者简介：李颖平（１９８０－），女，硕士，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｙｉｎｇｐｉｎｇ＿０８２０＠１６３．ｃｏｍ

２００６年第３期李颖平等：一种新的基因敲除术－ＲＮＡｉ

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射线虫时发现，基因抑制效应变得十分的微弱，而经过纯化的双链ＲＮＡ却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达，这一发现被称为ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）［３］。

２．５ＲＩＳＣ

它是由ｓｉＲＮＡ的反以链指导合成的一种核蛋

白复合体，在ＲＩＳＣ的指导下，靶ｍＲＮＡ替换ｓｉＲＮＡ的正义链，从而和ｓｉＲＮＡ中的反以链互补结合，随后结合在ＲＩＳＣ上的ＲｎａｓｅⅢ会从反义链一段切割靶ｍＲＮＡ为２１￣２３ｎｔ的小片段。

相关术语２．１ｄｓＲＮＡ

双链ＲＮＡ的形成可以通过几条途径实现：（１）在生物体内，当病毒入侵，转座子（ＴＥ）转录和基因组中的反相重复序列转录时，细胞中的ＲＮＡ可以通过两个ＲＮＡ互补链结合成分子间双链ＲＮＡ，也可以通过单个ＲＮＡ链自身回折，形成分子内双链ＲＮＡ，

（２）在生物体外，主要是利用人工合成一对互补的单链ＲＮＡ，然后可以先导入生物体内，在体内互补为双链ＲＮＡ，或先在体外互补为双链ＲＮＡ然后再导入体内。

２

３ＲＮＡｉ的作用机制［５］

第一步

双链ＲＮＡ的产生。

ｄｓＲＮＡ是诱导细胞ＲＮＡｉ的关键组分，外源ＤＮＡ序列可激发细胞中ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶

的催化下，合成病毒的ＲＮＡ序列的互补链，并与之结合形成ｄｓＲＮＡ。ＤＮＡ病毒，重组基因，转基因等

ＤＮＡ序列，在细胞转录出ＲＮＡ后，经ＲｄＲｐ形成ｄｓＲＮＡ，而由于转座子其本身具有反相重复序列，细

胞可以通读转录这种反相重复序列直接产生ｄｓＲ－

２．２

ＲｄＲｐ（依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶）

ｄｓＲＮＡ导入生物体内后，首先要经过一组特异的蛋白复合物识别ｄｓＲＮＡ，经ＲｄＲｐ以双链为模板复制ｃＲＮＡ，使双链ＲＮＡ浓度达到干涉所需的浓度。２．３Ｄｉｃｅｒ酶

Ｄｉｃｅｒ酶是ＲｎａｓｅⅢ家族中可以特异识别ｄｓＲＮＡ

的一种酶，这种酶具有接旋活性，在进化中具有保守

ＮＡ；细胞中正义和反以ＲＮＡ的同时转录也可以产

生ｄｓＲＮＡ；线虫中可以通过注射或浸泡在ｄｓＲＮＡ溶液中等方式引入外源ｄｓＲＮＡ；这种ｄｓＲＮＡ可以是分开的两个ＲＮＡ分子互补形成双链，也可以是一个

ＲＮＡ分子回折，自身互补，形成分子内双链。然而，

细胞是如何判断那些ＲＮＡ和ＤＮＡ是“异己”进而产生相应的ｄｓＲＮＡ，其机制尚不清楚。

第二步

性，在催化过程中需要ＡＴＰ的参与，通过接旋酶区域来指导ｄｓＲＮＡ解旋。有试验证明Ｄｉｃｅｒ酶不作用于单链ＲＮＡ，它一般作用于长度在２００￣５００ｂｐ的双链ＲＮＡ，对于更短的ＲＮＡ，Ｄｉｃｅｒ酶没有活性，这与

ｓｉＲＮＡ的形成。

形成的ｄｓＲＮＡ要在细胞中大量扩增，当其在细胞中达到一定量时，会被一种特异的核酸内切酶（Ｄｉｃｅｒ酶）切割，含有解旋酶活性和ＰＡＺ结构域。在此酶的作用下，细胞中的单链ｍＲＮＡ，会与ｄｓＲＮＡ的正义链发生互换，原先的ｄｓＲＮＡ中的正义链被

ＲＮＡｉ对双链ＲＮＡ的要求基本一致。由此看来，可

能正是Ｄｉｃｅｒ酶对底物的要求决定了ＲＮＡ对导入

ＲＮＡ的。Ｄｉｃｅｒ酶可消化ｄｓＲＮＡ。单有实验证

明，在动物中Ｄｉｃｅｒ酶可以将双链ＲＮＡ分解为两类截然不同功能的微小ＲＮＡ，微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）和小干涉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）。其中ｍｉＲＮＡ调节ｍＲＮＡ的翻译，而ｓｉＲＮＡ则指导经ＲＮＡｉ途径对ｍＲＮＡ的破坏作用。

ｍＲＮＡ代替，从酶ｄｓＲＮＡ复合物中释放出来，而ｍＲＮＡ则处于原先的正义链的位置，此后，在ＡＴＰ

的参与下，细胞中存在的另一复合体—ＲＮＡ诱导的沉默复合体利用结合在其上的核酸内切酶活性切割靶ｍＲＮＡ分子中与ｄｓＲＮＡ反以链互补的区域，形成了２１￣２３的核苷酸长的ｄｓＲＮＡ小片断，称之为短干涉ＲＮＡ。它又可以指导形成ＲＩＳＣ复合体。

第三步

２．４

ｓｉＲＮＡ（小干涉ＲＮＡ）

ｓｉＲＮＡ特异识别ｍＲＮＡ在近年的研究中发现，ｓｉＲＮＡ是ＲＮＡｉ作用的重要中间效应分子，ｓｉＲＮＡ长度大约是２１￣２５ｎｔ，是一种特殊的双链ＲＮＡ。特点：３＇端为羟基，５＇端为磷酸盐，其中３＇端有突出２￣３

个不配对的碱基。

ＲＮＡｉ的形成。

ＳｉＲＮＡ还可以作为一种特殊的引物，在ＲｄＲｐ

酶作用下以靶ｍＲＮＡ为模板合成ｄｓＲＮＡ分子，新的ｓｉＲＮＡ又可进入上述循环，这种过程称为随机降解性聚合酶链式反应（ｒａｎｄｏｍｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅＰＣＲ）。新

４４生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ

这是很受科学家欢迎的。

２００６年第３期生的ｄｓＲＮＡ反复合成和降解，不断产生新的ｓｉＲ－

ＮＡ，从而使靶ｍＲＮＡ渐进性减少，导致目的基因的

沉默，呈现ＲＮＡｉ现象。

第三，与传统的同源重组基因剔除技术以及

ＲＮＡ、ＤＮＡ嵌合分子介导的高效基因转变都只能一

次改变一个基因相比，利用ＲＮＡｉ可以实现多种基因的改变，这是利用传统的基因突变的方法无法实现的。

具体地讲，ＲＮＡｉ技术可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的双链ＲＮＡ分子，注射一种双链ＲＮＡ即可以产生多个基因同时剔除的表型，也可以同时注射多种ＲＮＡ而讲多个序列不相关的基因同时剔除。它可以仅仅在一周时间内关闭１０个基因表达。比基因剔除技术更快更高效，。此外，联合利用传统的缺失突变技术和ＲＮＡｉ技术可以很容易地确定复杂的信号转导途径中不同基因的上游关系；ＲＮＡｉ还可以产生基因降低表达的各种表型［４］。

４

４．１

ＲＮＡｉ的特点

ＲＮＡｉ的基本特点

（１）ＲＮＡｉ介导的是转录后水平的基因沉默（ＰＴＧＳ）机制。

（２）高稳定性。以３＇端悬垂ＴＴ碱基的ｄｓＲＮＡ

尤为稳定，无需像反义核酸那样进行广泛的化学修

饰以提高半衰期。

（３）高特异性。ＳｉＲＮＡ除正义链３＇端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外，其他单个碱基改变就可能使ＲＮＡｉ失效，而针对同源基因共有序列的ＲＮＡｉ则导致同源基因共同失活。

（４）高效率。少量的ｄｓＲＮＡ分子就能完全抑制相应基因的表达，能在低于反义核酸几个数量级的浓度下研究目标基因；比基因敲除术更快，更简单。而且，那些在胚胎中敲除后导致死亡的基因，也可以利用ＲＮＡｉ的方法在培养细胞中进行研究。

（５）双干涉系统。哺乳动物中存在两条相互的“干涉”途径：非特异性干涉反应，由＞３０ｂｐ序列的ｄｓＲＮＡ介导，可导致整个细胞非特异性蛋白合成抑制及ＲＮＡ降解；特异性干涉反应，由２１￣２３ｎｔ的

５ｓｉＲＮＡ的合成

早期，对于基因的研究，ｓｉＲＮＡ由化学合成。近

来，Ａｍｂｉｏｎ公司引进一项成套设备来进行体外的

ｓｉＲＮＡ的合成。并且一个试剂盒可以自行设计合成

多个ｓｉＲＮＡｓ，灵活性和可控性都明显提高，特别是有多个ｓｉＲＮＡ需要合成的时候，不失为一种经济的选择，其中涉及的ＤＮＡ合成的价格就便宜多了，即使是全球最著名的ＤＮＡ合成供应商Ｏｐｅｒｏｎ，也就是７￣９块钱一个碱基，通过专用的ＲＮＡ转染试剂，瞬时转染可以将这些ｓｉＲＮＡ转入细胞内进行实验。

ｓｉＲＮＡ介导，可逃避非特异性干涉系统的“监控”，

只降解与其序列相应的单个基因的ｍＲＮＡ；

（６）高穿透性。ＲＮＡｉ抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持，在线虫中干涉效应甚至可以传递到后代中去。

６ＲＮＡｉ的生物学意义

维持基因组稳定；保护基因组免受外源核酸的

４．２

ＲＮＡｉ技术优点

ＲＮＡｉ技术与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，ＲＮＡｉ技术具有明显的优点。

首先，它比反义ＲＮＡ技术和同源共抑制更有

效，能在低于反义核酸几个数量级的浓度下，使目标基因表达降到极低水平甚至完全“剔除”，从而产生缺失突变体表型。因此，更容易产生功能丧失和降低突变。

其次，与ＴＤＮＡ技术造成的功能永久性丧失相比，ＲＮＡｉ技术通过与细胞特异性启动子，及可诱导系统结合使用，其抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行，

侵入；基因表达。

７

７．１

ＲＮＡｉ的应用［６］

探索基因功能的有力工具

ＲＮＡｉ已经被应用到线虫的系统性功能基因组

研究上，ＲＮＡｉ作为一个常见的基因敲除工具，它的应用范围可以从单细胞的原生动物一直扩展到人。虽然ＲＮＡｉ已被广泛应用到不同种生物，但仍然有许多问题有待阐明。在功能基因组中的研究，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能，ＲＮＡｉ技术正合此意。

７．２抗病毒开发新药

２００６年第３期李颖平等：一种新的基因敲除术－ＲＮＡｉ

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可以利用ＲＮＡｉ技术产生抗病毒的植物和动物，使其转录产生相应于病毒繁殖关键基因的双链

阔的发展前景。由于能够快速而简单地制备某个功能缺失表型，使得更多的研究人员投身于ＲＮＡｉ的研究之中。尽管目前对这项功能强大的技术已经有深入的了解，但是几乎每天都有新的结果不断涌现，可以毫不夸张地说，ＲＮＡｉ正在功能基因组学领域掀起一场真正的。

ＲＮＡ，从而抵抗病毒的入侵和繁殖，而且可以利用

不同病毒的转录序列中高度同源区段相应的双链

ＲＮＡ实现抵抗多种病毒；ＲＮＡｉ技术可以抑制转座

子活动，防止自私基因的序列的过量增殖，控制生物体的发育和基因表达。研究还表明，ＲＮＡｉ效应可以由线虫成虫传递给子代，暗示获得性遗传有可能存在，通过吞食大肠杆菌，线虫还能从大肠杆菌获得ＲＮＡｉ信号，说明ＲＮＡｉ信号还能实现种间传递。线虫和果蝇的全基因序列都已测序完毕，发现大量未知功能的新基因。

ＲＮＡｉ已被广泛应用到不同种生物，但仍然有

许多问题有待我们进一步阐明，例如：不同种生物是否沿用同一种ＲＮＡｉ机制，ＲＮＡｉ机制本身又受到那些，转录后的ＲＮＡｉ是否与核内转录有某种联系，ＲＮＡｉ是否与转录水平相耦联，ＲＮＡ逆向信息传递反作用于ＤＮＡ，生命的信息是否起源于ＲＮＡ，如何更有效地将ｓｉＲＮＡ导入哺乳动物的细胞，进行基因功能的研究以及疾病基因治疗等。

参考文献

７．３基因治疗

ＲＮＡｉ技术为某些疾病的基因治疗提供新的思

路，通过ＲＮＡｉ技术抑制癌基因的表达，，可能成为一种新的癌症基因治疗策略，最后，人们可以利用能抑制ＲＮＡｉ的病毒蛋白来预防转基因所诱发的

１２３４５６７

孟祥兵，王秀芳．生命的化学，２００１，２１（２）：１１１￣１１３．段发平，梁承邺．生物学通报，２００２，３７（３）：１５￣１６．

ＲＮＡｉ，使转基因得到充分的表达［７］。

８展望

Ｂｏｓｈｅｒ认为ＲＮＡｉ将是未来十年生物学研究中

ＭａｒｘＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８８（５４７０）：１３７０￣１３７２．汤富酬，薛友纺．遗传，２００１，２３（２）：１６７￣１７２．

孙建国，陈正堂．生物化学与生物物理进展，２００２，２９（５）：６７８￣６８１．陈忠斌，于乐成，王升启．中国生物化学与分子生物学研究学报，

最激动人心最有可能产生丰富成果的领域之一。尤其是对细胞中基因功能的分析和基因特异性的治疗方面的突出优势，在未来的发展中将具有更加广

２００２，１８（５）：５２５￣５２８

雷迎峰．国外医学分子生物学分册［Ｍ］，２００２，２４（４）：１９６￣１９９．

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!（上接第１３页）

２００１，２２５（１～２）：２１～２９．１４１５１６１７１８

朱以华，王强斌，等．中国医学科学院学报，２００２，２４（２）：１１８～

８９１０１１１２１３

ＮｏｒｉｏＭ，ＨｉｒｏｎｏｒｉＮ，ＲｙｕｉｃｈｉＭ，ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈＲｅｓＣｏ，２００５，３３４（４）：１１２１～１１２６．

向娟娟，聂新民，等．中华肿瘤杂志，２００４，２６（２）：７１～７４．

１２３．

ＨｅｒｂｅｒｔＭ．Ｒｅｉｎｌ，ＭｉｃｈａｅｌＰｅｌｌｅｒ，ＭａｒｋＨａｇｍａｎｎ，ｅｔａｌ．Ｍａｇｎ１０２０．ＲｅｓｏｎＩｍａｇｉｎｇ，２００５，２３（１０）：１０１７～

王晓光，胡红，等．中华医学杂志，２００４，８４（ｌ６）：１３９３～１３９５．

ＣｈｒｉｓｔｏｐｈＡ，ＲｏｌａｎｄＪ，ＲｏｓｗｉｔｈａＳ，ｅｔａｌ．ＪＭａｇｎＭａｇｎＭａｔｅｒ，２００５，２９３（１）：３８９～３９３．

龚连生，张阳德，等．中国现代医学杂志，２００１，１１（３）：１４～１６．

６）：ＩｔｏＡ，ＨａｙａｓｈｉｄａＭ，ＨｏｎｄａＨ，ｅｔａｌ．ＴｉｓｓｕｅＥｎｇ，２００４，１０（５～８７３～８８０．

ＩｔｏＡ，ＴａｋｉｚａｗａＹ，ＨｏｎｄａＨＨａｔａ，ｅｔａｌ．ＴｉｓｓｕｅＥｎｇ，２００４，１０（５～６）：８３３～８４０．

ＣｈｕｎｆｕＺｈ，ＨａｎｗｅｎＳ，ＪｉａｏｙｕｎＸ，ｅｔａｌ．ＪＭａｇｎＭａｇｎＭａｔｅｒ，２００５，２９３（１）：１９３～１９８．

ＪｈｕｎｕＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ，ＹｏｕｓｅｆＨａｉｋ，ＣｈｉｎｇＪｅｎＣｈ．ＪＭａｇｎＭａｇｎＭａｔｅｒ，