水-硅油双相体系对多环芳烃降解菌的筛选及鉴定

生态环境学报２０１０，１９（８）：１８８７—１８９２　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｅｅｓｃｉ．ｃｏｍ　Ｅ．ｍａｉｌ：ｅｄｉｔｏｒ￣ｉｅｅｓｃｉ．ｔｏｍ　水一硅油双相体系对多环芳烃降解茵的筛选及鉴定　刘芳，梁金松，李季　中国农业大学资源与环境学院，北京１００１９３　摘要：选用水．硅油双相体系驯化筛选降解多环芳烃的优势菌株。筛选体系为：５０　ｍＬ无机盐溶液＋１０　ｍＬ硅油。从７４瓶富　集液中，对降解效果明显的富集液进行多环芳烃降解率的液相色谱定量测定。对蒽的降解率最高为４５％；对荧蒽的降解率　最高为９９％，几乎全部降解，对苯并［ａ］芘的降解率为２７％。筛选到一株能够高效降解蒽、菲、芘、荧蒽的菌株，编号ＬＤ２９，　鉴定结果为矢野口鞘氨醇杆菌ＬＤ２９（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍｙａｎｏｉｋｕｙａｅ　ＬＤ２９　ｏ富集液Ｙ１２对５种多环芳烃的降解效果同样很明显。　关键词：水．硅油；多环芳烃；降解；筛选　中图分类号：Ｘ１７２　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７４—５９０６（２０１０）０８—１８８７－０６　多环芳烃（ＰＡＨｓ）是一类在自然界广泛存在的　难降解的有机污染物，一些微生物经过驯化，能以　其作为碳源生长、繁殖。通：过人工富集、培养，可　分离出能降解ＰＡＨｓ的微生物Ｉｌ之Ｊ。但这类物质通常　蒽、荧蒽、苯并［ａ］芘、乙腈均为色谱纯，购自　Ｓｉｇｍａ．Ａｌｄｒｉｃｈ公司，其他试剂为分析纯。硅油密度　为０．９６　ｇ．ｃｍ一。　１．２实验方法　要求在有其他碳源或能源物质共存的条件下才能　部分或全部降解（即共代谢作用），且大多数微生物　对有机物的降解作用主要在水相中进行，难溶于水　的有机物的降解不易进行或只能在界面进行，这就　使ＰＡＨｓ降解菌的筛选和分离十分困难ｌ３Ｊ。利用相　似相溶的原理，可以降低水相中多环芳烃的浓度，　１．２．１培养基　细菌培养基：牛肉膏３　ｇ，蛋白胨５　ｇ，琼脂ｌ８　ｇ，水１　０００　ｍＬ，ｐＨ　７．０～７．２。固体加１．５％～２％左右　琼脂　基本无机盐培养基：ＭｇＳＯ４‘７　Ｈ２０　０．２　ｇ，　ＫＨ２ＰＯ４　１．０　ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４　１．０　ｇ，ＦｅＣ１３或ＦｅＳＯ４０．０５　并提供两相交互界面的筛选条件。目前常用的有机　溶剂有：硅油、２，２，４，４，６，８，８一七甲基壬　烷、癸烷、十二烷、十六烷、十八烷、二乙基癸二　酸酯、十一醇、油醇等。陶雪琴等ｌ４Ｊ就采用水．硅油　ｇ，ＣａＣ１２　０．０２　ｇ，ＮＨ４ＮＯ３　１．０　ｇ，ＮａＣ１　０．５　ｇ，水１　０００　ｍＬ，ｐＨ　７．５。　１．２．２水一硅油双相体系　双相体系筛选出了对多环芳烃菲有很好降解效果　的混合菌。　目前多环芳烃降解菌的驯化方法主要是传统　的单一水相体系无机盐筛选方法　Ｊ。筛选周期长，　筛选出的菌种不多Ｌ２Ｊ，而且大部分都是针对单一、　低环的多环芳烃有降解效果Ｉ６］。自然界中多环芳烃　用丙酮分别配制蒽、荧蒽、苯并［ａ】芘溶液，之　后０．２２　ｕｍ的微孔滤膜过滤除菌，取一定量的上述　溶液置于灭菌的三角瓶中，待有机溶剂挥发后加入　灭菌的基本无机盐培养基，文中如未说明，蒽、荧　蒽的终质量浓度为１００　ｍｇ・Ｌ～，苯并［ａ］芘的终质量　浓度为１０　ｍｇ－Ｌ～。　本实验采用的水一硅油双向体系设置如下：　５０　ｍＬ无机盐溶液＋１０　ｍＬ硅油；　降解菌的富集设以下４个处理：１８０　ｒ・ｍｉｎ～，　３０℃，避光培养。　处理１：蒽（１００　ｍｇ・Ｌ　）（Ｎ１一Ｎ１７）；　处理２：荧蒽（１００　ｍｇ・Ｌ。）（Ｙ１一Ｙ１７）；　处理３：苯并［ａ］芘（１Ｏ　ｍｇ・Ｌ　）（１３１一Ｂ１７）；　处理４：蒽＋荧蒽＋苯并［ａ］芘（３３＿３　ｍｇ・Ｌ～＋３３＿３　ｍｇ‘Ｌ　＋３．３３　ｍｇ‘Ｌ　）（Ｈ１－Ｈ１７）１７个样品，共６８瓶，　水一硅油双相体系见图１。　都是相伴存在的，如果只能降解其中一种多环芳　烃，不利于在生产实践中的应用。硅油就是一种很　好的疏水性有机溶剂，不仅对热稳定、难以光解、　而且不能生物降解。微生物在两相界面或水相中利　用ＰＡＨｓ作为唯一碳源，既能为微生物生长提供足　够的营养，又不抑制微生物的活性【７】。本实验利用　水一硅油双向体系筛选出的降解体系能够降解五种　多环芳烃，且降解效果显著。应用前景广阔。　１材料与方法　１．１　目标污染物　基金项目：　广东省教育部产学研结合项目（２００７Ｂ０９０４００１０１）　作者简介：　刘芳（１９８１年生），女，博士，研究方向为环境微生物。Ｅ—ｍａｉｌ：ｔｂｌｉｕｆａｎｇｃａｕ＠１６３．ｃｏｒｎ　通讯作者：李季（１９６５年生），男，研究方向为固体废弃物处理。Ｅ．ｍａｉｌ：ｔｂｌｉｕｆａｎｇ１９８０＠ｓｉｎａ　ｃｏｒｎ　收稿日期：　２０１０—０６—１０　１８８８　生态环境学报第１９卷第８期（２０１０年８月）　法如Ｆ：　从富集液中吸取１　ｍＬ混合菌液，加入含有多　环芳烃的无机盐溶液中，浓度与富集液中的多环芳　烃浓度相同，５　ｄ后，进行液相色谱的定量测定。　均设３次重复。　１．２．４　ＰＡｌ－Ｉｓ残留量测定　图１水．硅油双相体系　Ｆｉｇ．１　Ｗａｔｅｒ—ｓｉｌｉｃｏｎｅ　ｏｉｌ　ｂｉｐｈａｓｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ　第一代富集液为土样富集液，每瓶加入５　ｇ土　样。驯化周期为１４　ｄ。处理４在第二代富集之后，　其中２瓶富集液，即：Ｈ２、Ｈ３出现了明显颜色变　化，硅油相粉红色，水相有的为黄色，有的为粉红　色。于是，对有颜色变化的多环芳烃混合富集液增　加了３个处理　ｊ（６瓶，共７４瓶）。　处理ｌ：蒽＋荧蒽（５０　ｍｇ・Ｌ～＋５０　ｍｇ・Ｌ　）；　处理２：蒽＋苯并芘（５０　ｍｇ・Ｌ　＋５　ｍｇ・Ｌ　）；　处理３：荧蒽＋苯并芘（５０　ｍｇ・Ｌ　＋５　ｍｇ・Ｌ　）；　编号分别为：Ｈ２（Ｙ＋Ｎ）ｆＮ＋Ｂ）（Ｙ＋Ｂ）；Ｈ３（Ｙ＋Ｎ）　（Ｎ＋Ｂ）（Ｙ＋Ｂ）　培养结束，向每个试管中加１０　ｍＬ乙酸乙酯，　涡旋３０　Ｓ。静置待水层与有机层分离，用移液管从　上层有机层取１　ｍＬ乙酸乙酯到干净的棕色玻璃瓶。　５５℃下用氮气流轻轻吹乙酸乙酯至完全挥发，再加　入２　ｍＬ乙腈溶解结晶的ＰＡＨｓ。用０．２２　Ｉ．ｔｍ孔径的　有机相滤膜过滤乙腈溶液到另一干净的棕色玻璃　瓶中，盖上盖。用安捷伦ＬＣ１２００高效液相色谱仪　测定多环芳烃残留率。采用Ｖｅｎｕｓｉｌ　ＭＰ　Ｃ１８柱（５　帅粒径，４　１ＴＩＩＴＩ直径，长度２５０　ｒｎｌＴｌ，天津博纳艾　杰尔科技），流动相为乙腈和水。前５　ｍｉｎ内采用　６０％乙腈洗脱，在接下来的２５　ｍｉｎ，乙腈梯度洗脱　到１００％，１００％洗脱保持５　ｍｉｎ，共计３５　ｍｉｎ。　１．２．５测序和分析　序列的同源性在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中使用　ＢＬＡＳＴ工具进行比较，然后用ＣＬＵＳＴＡＬＸ　１．８进　行比对，然后用ＭＥＧＡ　３．１构建目录树。ＬＤ２９的　测序和理化试验由中国科学院微生物所完成。　２结果与分析　２．１　葸、荧蒽、苯并【ａ】芘降解菌（单菌株）的筛　选　考虑到蒽、荧蒽、苯并［ａ］芘多环芳烃在水中的　溶解度都比较低，要筛选出对多环芳烃，尤其是４　环以上的高环多环芳烃的高效降解菌株，必须选择　一共驯化培养８代，每代为７　ｄ。因摇床温度变　化，个别驯化周期有调整，最多为１０　ｄ，见表１。　１．２．３多环芳烃降解率的测定　本实验采用水一硅油双相体系进行多环芳烃降　解菌的筛选。从直观来看，有颜色变化的富集液中　有高效多环芳烃降解菌的存在［４］。实验共有富集液　７４瓶，由于样品太多，还需要对有降解效果的混合　菌液进行定量筛选，对降解效果明显的混合菌进行　分离实验。以期筛选到高效降解的单株菌。具体做　个好的驯化方法。本实验主要选用水一硅油双相体　系驯化筛选降解多环芳烃的优势菌株。经过最初通　过对土样的驯化培养１４　ｄ后，驯化结果见表２，驯　化过程中的摇瓶颜色变化见图２。　２．２蒽、荧蒽、苯并芘【ａ】降解菌的分离　从７４瓶富集液中，对降解效果明显的富集液　进行多环芳烃降解率的液相色谱定量测定，为下一　步降解菌的分离实验提供数据指导。　表１　水一硅油双相体系驯化筛选条件　Ｔａｂ　ｌ　Ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ－ｓｉｌｉｃｏｎｅ　ｏｉｌ　ｂｉｐｈａｓｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ　因摇床温度变化，个别驯化周期有调整，最多为１０　ｄ　刘芳等：水一硅油双相体系对多环芳烃降解菌的筛选及鉴定　表２水一硅油双相体系中以蒽、荧蒽、苯并【ａ１芘　为唯一碳源驯化培养的摇瓶记录　Ｔａｂ　２　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆｍｉｘｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｉｔｅ　ｕｓｉｎｇ　Ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ　Ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｅ　Ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ　ａｓ　ｓｏｌｅ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ－ｓｉｌｉｃｏｎ　ｏｉｌ　ｂｉｐｈａｓｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ　驯化碳源　摇瓶培养观察结果　垂霉　Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｉ●・●　１。。　８。　ｓ。　２。　０　图４不同富集ｊｋ１１甍龛　紧　的降解率　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｌｆｕｏｒａｎｔｈｅｎｅ　ｂｙ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｒｏｍ　ｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｉｘｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　４０　圈２水．硅油双相体系中以蒽、荧蒽、苯并【ａ】芘为唯一碳源驯化培养　的摇瓶颜色变化　Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｃｏｌｏｒ　ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ｍｉｘｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｉｔｅ　ｕｓｉｎｇ　Ａｎ—　３０　ｔｈｒａｃｅｎｅ　Ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｅ　Ｂｅｎｚ０［ａ】ｐｙｒｅｎｅ　ａｓ　ｓｏｌｅ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｉｎ　ｗａ－　ｔｅｒ－ｓｉｌｉｃｏｎ　０｜ｌ　ｂｉｐｈａｓｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ　譬２０　世　１０　０　Ｈ３　我们选取了Ｎ２、Ｎ３、Ｎ１４、Ｎ１６、Ｙ２、Ｙ１１、　ＹＩ２、Ｈ２（Ｙ＋Ｂ）、Ｈ３（Ｙ＋Ｂ）、Ｈ２（Ｎ＋Ｙ）、Ｈ３（Ｎ＋Ｙ）、　・　Ｈｌ４　混合菌系　图５不同富集液中混合菌对苯并【ａ］的降解率　Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ　ｂｙ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｍｉｘｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　Ｈ２、Ｈ３、Ｈ１４共ｌ４瓶富集液进行液相色谱的定量　测定，使下一步的混合菌分离实验更为合理，也能　相应减轻混合菌的分离工作，为筛选到高效降解多　环芳烃的菌株节省时间，提高效率。同时，也为降　解菌株的降解实验做充分的准备。蒽的降解率见图　３，荧蒽的降解率见图４，苯并［ａ］芘的降解率见图５。　从图３中可以看出，Ｈ２、Ｈ３对于蒽的降解率　最低，分别为２１％和３６％；Ｎ２、Ｎ３、Ｎ１４、Ｎ１６、　Ｈ３（Ｎ＋Ｙ）对于蒽的降解率很相近，为４５％左右。Ｈ２、　Ｈ３为混合３种多环芳烃混合溶液，包括蒽、荧蒽　和苯并［ａ］芘，Ｎ２、Ｎ３、Ｎ１４、Ｎ１６为以蒽为唯一碳　源的富集液，Ｈ３（Ｎ＋Ｙ）富集液中包括蒽和荧葸。Ｈ２、　Ｈ３的降解率低，可能是富集液中高环多环芳烃的　毒性作用，存在４环的荧蒽和５环的苯并［ａ］芘，也　可能是因为没有高效降解蒽菌株的存在。Ｈ３　＋Ｙ）　的降解率略低，可能是因为荧蒽的存在对于蒽的降　解有一定的阻碍作用，４环荧葸对于微生物的毒害　作用要大于３环的蒽。可以初步判断，Ｈ２、Ｈ３、　Ｎ２、Ｎ３、Ｎ１４、Ｎ１６、Ｈ３　＋Ｙ）这７瓶富集液中存　在高效降解蒽的菌株，可以作为蒽降解菌分离的混　合菌液。　从图４中可以看出，Ｙ２、Ｙ１ｌ对于荧蒽的降解　率最低，分别为３２％和３８％；Ｈ３对于荧蒽的降解　率最高，为９９％，几乎全部降解。Ｙ１２、Ｈ２（Ｎ＋Ｙ）、　Ｈ３（Ｎ＋Ｙ）、Ｈ２（Ｙ＋Ｂ）对于荧蒽的降解率也很高，分　别为８７％、８６％、９３％、８Ｉ％。Ｈ１４与Ｈ３（Ｙ＋Ｂ）对　生态环境学报第１９卷第８期（２０１０年８月）　于荧蒽的降解率很相近，分别为５８％和６０％。Ｈ３、　Ｈ１４为混合三种多环芳烃混合溶液，包括蒽、荧蒽　和苯并『ａ］芘，Ｙ２、Ｙ１１、Ｙ１２为以荧蒽为唯一碳源　的富集液，Ｈ２（Ｎ＋Ｙ）、Ｈ３（Ｎ＋Ｙ）富集液中包括蒽和　荧蒽，Ｈ２（Ｂ＋Ｙ）、Ｈ３（Ｂ＋Ｙ）富集液中包括荧蒽和苯　并［ａ］芘。可以初步判断，Ｙ２、Ｙ１１富集液中不存在　高效降解荧蒽的菌株，其余７瓶富集液中存在高效　降解荧蒽葸的菌株，可以作为蒽降解菌分离的混合　菌液。Ｈ３对于荧蒽的降解在５　ｄ就能达到９９％不仅　说明存在高效降解荧蒽的菌株，同时也说明了微生　物共代谢机理在多环芳烃降解中的体现，即在有其　他碳源和能源存在的条件下，微生物酶活性增强，　降解非生长基质的效率提高。称为共代谢作用Ｌ８ｊ。　从图５中可以看出，Ｈ３对于苯并【ａ】芘的降解　率为２７％，Ｈ１４对于苯并［ａ】芘的降解率为１　１％。苯　并［ａ］芘为５环的多环芳烃，微生物对其的代谢基本　为共代谢，而且很难降解。沈德中研究表明，微生　物降解ＰＡＨｓ的难易程度取决于其化学结构的复杂　性和降解酶的适应程度　ｊ。另外，影响微生物降解　ＰＡＨｓ的因素还有温度、盐度、ｐＨ值、通气状况、　营养盐和ＰＡＨｓ浓度等。巩宗强等报道，向土壤中　加人多环芳烃的代谢中间产物水杨酸等有机物，能　提高微生物酶的活性，促进芘共代谢降解过程的进　行，此外，营养物质的加入对提高共代谢率也是很　重要的。共代谢作为一种代谢机制，不仅有助于更　加准确地认识环境中存在共代谢情况下的生物降　解，而且为寻求生物降解技术提供了新思路【ｌｏ。…。　为了能筛选到高效降解多环芳烃的菌株，我们　根据颜色变化和色谱数据选取了Ｎ２、Ｎ３、Ｎｌ４、　ＮＩ６、Ｙ２、Ｙ１１、Ｙ１２、Ｈ２（Ｙ＋Ｂ）　Ｈ３（Ｙ＋Ｂ）、Ｈ２（Ｎ＋Ｙ）、　图６富集液Ｎ１６　Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｍｉｘｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｎ１６　图７　ＬＤ２９菌藩形态　Ｆｉｇ．７　ＬＤ２９　Ｃｏｌｏｎｙ　ｍｏｏｈｏｌｏ￣　Ｈ３（Ｎ＋Ｙ）、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ１４共１４瓶富集液作为混合　菌进行分离，以期能分离出能够高效降解多环芳烃　的纯菌。最终，我们筛选到一株能够高效降解蒽、　菲、芘、荧蒽的菌株，编号ＬＤ２９，来自土样编号　为ｌ６，富集液编号为Ｎ１６。富集液颜色见图６，巧　ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ　ＬＤ２９　ｏ用ＧｅｎＢａｎｋ　Ｂｌａｓｔ软件进行序列　相似性比较，结果显示菌株ＬＤ２９的１６ＳｒＤＮＡ序列　与Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ　Ｂ１相似性９９％【Ｊ　，与　Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｓｐ．ｃｌｏｎｅ　ＧＩ５・００７一Ａ０８相　合的是，与ＬＤ３１来自于同一土样。该土样中有机　质、总磷、总钾、总氮质量分数分别为２９．４　ｇ・ｋ譬～、　０．５４　ｇ‘ｋｇ～、０．０１　ｇ。ｋｇ～、０．５　ｇ。ｋｇ～，ｐＨ　８．１２，电导　率０．１４ｍｓ・ｃｍ－　，含水率０．８６％。　２．３菌株ＬＤ２９的形态观察　ＬＤ２９在３０℃恒温培养箱培养，在牛肉膏平板　上，第二天就能看到淡黄色的针尖大小的菌落。呈　规则圆形，表面湿润、光滑、突起，边缘整齐，不　透明，质地粘稠（见图７）。　２．４分离菌株ＬＤ２９的１　６ＳｒＤＮＡ序列分析　序列测定得到１　３６５ｂｐ的１　６ＳｒＤＮＡ部分序列，　鉴定结果为矢野１２Ｉ鞘氨醇杆菌ＬＤ２９（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　似性９９％【Ｉ川。基于１６ＳｒＤＮＡ的系统的构建发育树　见图８，电境图片见图９。目前对于矢野口鞘氨醇　杆菌对于多环芳烃降解的研究较少。有研究表明　Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ　Ｂ１能够降解多种多环芳　烃，该菌株的存在会促进受污染土壤中其他微生物　的生长，与其他微生物存在生态位的竞争【１刚。　２．５菌株ＬＤ２９的保藏　取单菌落在平板上划线，３０℃培养，待长出菌　落将培养吼用封口膜封住，倒置于４℃冰箱，可存　放１个月。挑取单菌落用接种环以无菌操作在斜面　上作划线接种。置３０℃恒温箱中培养７２　ｈ。保藏斜　面长好后，直接放入４℃的冰箱中保藏。这种方法　般可保藏３￣６个月。无菌操作下将５　ｍＬ石蜡油　加入到培养好的菌种上面，石蜡油封存以后，同样　一刘芳等：水一硅油双相体系对多环芳烃降解菌的筛选及鉴定　Ｓｐｂｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＰＦ－Ｄ　Ｓｐｈｉｎ￥ｏｍｏｎｔｓｙａｎｏｉｈｕｙ＇ａｏ（ＡＦ３３１６６１．１）　Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍｙｍｍ／／ｍｙａｅ￣ｔｒａｉｎ　ＢＦ・１８　ＬＤ２９　Ｓ＃ｉｎｇｏｍｏｎ￣ｓｐ。ＳＺＬ－Ｉ　ｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＺｎＨ一１　咖　｜ｌ，ａｎ龄ｓｐ．ＰＦ－Ｋ　劬ｈ他睁６　哪对　。　ｃ（ＡＢ１０９７４９．Ｉ）　衄窖伽０ｎ越￥ｐ．ＲＦ－１２　ＳｐｈｉｎｇｏＭｕｍｙａｎｏｉｌｍｙａｅｓｔｒａｉｎ　ＸＪ　Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．ＰＨ－０７　图８基于１６ＳｒＤＮＡ序列构建的菌株ＬＤ２９的系统发育树　Ｆｉｇ．８　Ｐｈｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　１　６ＳｒＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　ＬＤ２９　Ａ　Ｂ　图９　ＬＤ２９的电镜照片（Ａ：放大５　０００倍；Ｂ：放大１０　０００倍）　Ｆｉｇ．９　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｒｔａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ　ｏｆＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍｙａｎｏｉｋｕｙａｅ　ＬＤ２９（Ａ：ｍａｇｎｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ｘ５　０００；Ｂ：ｍａｇｎｉｉｆｃａｔｉｏｎ，×１０　０００　放入４℃冰箱中保存。这种方法保藏期一般为１～２　ａ。　为使其保持高效降解多环芳烃的特性，同时采　用以荧蒽为唯一碳源的无机盐液体培养基保存。实　验步骤为：取１　ｍＬ菌液，加到３０　ｍＬ含荧蒽（１Ｏ０　ｍｇ・Ｌ。）的无机盐培养基中，摇瓶培养３￣４天后，　［ａ］芘为碳源的无机盐液体培养基保存。实验步骤同　ＬＤ２９菌株的保存。　保藏于４℃冰箱中。２～３个月转接一次。　２．６　蒽、荧蒽、苯并［ａ】芘降解菌（混合菌）的　筛选　实验发现，富集液Ｙ１２对于５种多环芳烃的降　解效果同样很明显，但遗憾的是，我们未能从中分　离出能够降解多环芳烃的纯菌，分离出的纯菌均没　有降解效果。我们推断，可能高效降解菌株为不可　培养微生物，也可能只有菌株一起存在才有降解效　３结论　（１）主要选用水一硅油双相体系驯化筛选出能够　高效降解多环芳烃的优势菌株。筛选体系为：５０　ｍＬ　无机盐溶液＋１０　ｍＬ硅油。富集过程中，有的富集　液颜色呈红色，有的呈黄色，对其中有颜色变化的　ｌ４瓶富集液进行液相色谱的定量测定。结果表明：　对于蒽的降解率为４５％；对于荧蒽的降解率最低为　３２％和３８％；对于荧蒽的降解率最高为９９％，几乎　全部降解。对于苯并【ａ］芘的降解率为２７％。　（２）筛选到一株能够高效降解蒽、菲、芘、荧　蒽的菌株，编号ＬＤ２９，来自土样编号为ｌ６，富集　液编号为Ｎ１６。与ＬＤ３ｌ来自于同一土样。序列测　果。对于Ｙ１２的保存，我们采用以蒽、荧蒽、苯并　ｌ８９２　生态环境学报第ｌ９卷第８期（２０１０年８月）　定得到１３６５ｂｐ的１６ＳｒＤＮＡ部分序列，鉴定结果为　矢野口鞘氨醇杆菌ＬＤ２９（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｙａｎｏｉｋｕｙａ　ＬＤ２９　ｏ　ＹＡＮＧ　Ｚｈａｎｗｅｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＡＨｓ　ｉｎ　ｓｏｉｌｓ［Ｊ］．　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，２００８，３７（１）：３０．３３．　［７］张从，沈德中，韩清鹏，等．水一硅油双相系统筛选分离多环芳烃　降解菌【Ｊ１ｌ环境科学学报，２００２，２２（１）：１２６．１２８．　ＺＨＡＮＧ　Ｃｏｎｇ，ＳＨＥＮ　Ｄｅｚｈｏｎｇ，ＨＡＮ　Ｑｉｎｇｐｅｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ＰＡＨｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｗａｔｅｒ－ｓｉｌｉｃｏｎ　ｏｉｌ　（３）富集液Ｙ１２对于５种多环芳烃的降解效果　同样很明显，但未能分离出能高效降解多环芳烃的　纯菌　参考文献：　ｌ１】孟范平．土壤的ＰＡＨｓ污染及其生物治理技术进展【Ｊ１．土壤学进展，　１９９５，２３（１）：３２—４２．　ＭＥＮＧ　Ｆａｎｐｉｎｇ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｆ　ｓｏｉｌ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｂｉｏ．ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｂｉｐｈａｓｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｉｒｃｕｍｓｔａｎｔｉａｅ，２００２，２２（１）：　１２６—１２８．　［８］ＧＲＩＦＯＬＬ　Ｍ，ＳＥＬＩＦＯＮＯＶ　Ｓ　Ａ，ＧＡＴＬＩＮ　Ｃ、‘ｅｔ　ａ１．Ａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｆｌｕｏｒｅｎｅ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｏｎ　ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｅ　ａｒｏｍａｔｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９５，６１（１０）：３７１１—３７２３．　［９】沈德中．污染环境的生物修复［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２００２：　１８一ｌ２４．　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，２３（１）：３２—４２．　［２］姜永海，韦尚正，席北斗，等．ＰＡＨｓ在我国土壤中的污染现状及其　研究进展［Ｊ］＿生态环境学报，２００９，１８（３）：１１７６．１１８１　ＪＩＡＮＧ　Ｙｏｎｇｂａｉ，ＷＥＩ　Ｓｈａｎｇｚｈｅｎｇ，ＸＩ　Ｂｅｉｄｏｕ，ｅｔ　ａｌ　Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ　ａｒｏ—　ＳＨＥＮ　Ｄｅｚｈｏｎｇ　Ｔｈｅ　Ｂｉｏ—ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｌｌｕｔａｎｔ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ［Ｍ］．　Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００２：１８—１２４．　［１ｏ】巩宗强，李培军，王新．芘在土壤中的共代谢降解研究【Ｊ］．应用生　态学报，２００１，１２（３）：４４７．４５０．　ｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏ　ｃａｒｂｏｎｓ（ＰＡＨｓ）ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｏｉｌｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ：ｒｅｃｅｎｔ　ａｄ－　ｖａｎｃｅｓ　ａｎｄ　ｆｕｔｕｒｅ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ［Ｊ］．Ｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　２００９，１８（３）：Ｉ１７６—１１８１　ＧＯＮＧ　Ｚｏｎｇｑｉａｎｇ，Ｌｉ　Ｐｅ￣ｕｎ，Ｗａｎｇ　Ｘｉｎ　Ｃｏ－ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｙｒｅｎｅ　ｉｎ　ｓｏｉｌ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，２０１０，ｌ２（３）：　４４７．４５０．　［３］ＢＩＴＺＵ　Ｕ　Ｔｈｅ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｘｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｓｏｌｖｅｎｔｓ　ｂｙ　ｍｉｘｅｄ　ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ，１９９１，３７（１　１）：　１０３７．１０４２．　［１１］宋雪英，李昕馨，伦小文，等．张士灌区多环芳烃污染土壤的植物　修复［Ｊ］．生态环境学报，２００９，１８（２）：５３１—５３４．　ＳＯＮＧ　Ｘｕｅｙｉｎｇ，ＬＩ　Ｘｉｎｘｉｎ，Ｌｕｎ　Ｘｉａｏｗｅｎ，ｅｔ　ａ１．Ｐｈｙｔｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ　ａｒｏｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ　ｆａｒｍｌｎｄ　ｓｏｉａｌ　ｉｎ　［４］　陶雪琴，卢佳宁，易筱筠，等．菲高效降解菌的筛选及其降解中间　产物分析［Ｊ］．农业环境科学学报，２００６，２５（１）：１９０．１９５　ＴＡＯ　Ｘｕｅｑｉｎ，ＬＵ　Ｊｉａｎｉｎｇ，ＹＩ　Ｘｉａｏｙｕｎ，ｅｔ　ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｈｅｎａｎ—　ｔｈｒｅｎｅ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｏｆ　Ｚｈａｎｇｓｈｉ　ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ　ｉｍｇ￣ｉｏｎ　ａｒｅａ［Ｊ］．Ｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｎｅｔ，　２００９，ｌ８（２）：５３　１－５３４．　Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｏ・ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，２５（１）：　１９０．１９５．　［１２】ＷＡＮＧ　Ｙ　ＬＡＵ　Ｐ　Ｃ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｌ　ｉｓｏｃｉｒｔａｔｅ　ｄｅｈｙ—　ｄｒｏｇｅｎａｓｅ—ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　ａ　ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ　ａｒｏｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ　［５】侯树字，张清敏，余海晨，等．多环芳烃芘高效降解菌的筛选及其　降解性能的研究ｆＪ］．南开大学学报：自然科学版，２００６，３９（２）：　７１．７４．　ｏｘｉｄｉｚｅｒ，Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ　Ｂ１［Ｊ】．Ｇｅｎｅ，１９９６，１６８（１）：１５－２１　［１３】ＬＡＤＵＣＭＴ，ＯＳＭＡＮ　Ｓ，ＶＡＩＳＨＡＭＰＡＹＡＮ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｃｅｎｓｕｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｃｌｅａｎ　ｒｏｏｍｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ＤＮＡ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｎｄ　ｃｌａｏｎ—　ＨＯＵ　Ｓｈｕｙｕ，ＺＨＡＮＧ　Ｑｉｎｇｍｉｎ，ＹＵ　Ｈａｉｃｈｅｎ，ｅｔ　ａ１．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｃｕｌｔｉ—　ｖａｔｉｏｎ　ｏｆｈｉｇｈ・－ｅｆｉｃｉｆｅｎｔ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｄｅｇｒａｄａ—－　ｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，７５（２０）：　６５５９．６５６７．　ｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏｗａｒｄｓ　Ｐｙｒｅｎｅ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｓｃｉｅｎｔｉａｒｕｍ　Ｎａｔｕｒａｌｉｕｍ　Ｕｎｉｖｅｒ－　ｓｉｔｙ　Ｎａｎｋａｉｅｎｓｉｓ，２００６，３９（２）：７１－７４　【１４】ＣＵＮＬＩＦＦＥＭ，ＫＥＲＴＥＳＺＭＡ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍｙａｎｏｉｋｕｙａｅＢＩ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｄｙｎａｍｉｃｓ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ　ａｒｏｍａｔｉｃ　［６】杨占文．土壤中多环芳烃菲和芘降解的研究进展Ⅲ２００８，３７（１）：３０－３３．　Ｌ“东化１二，　ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｇｅｄ　ａｎｄ　ｆｒｅｓｈｌｙ　ＰＡＨ—ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ　ｓｏｉｌｓ［Ｊ］Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ，２００６，１４４（１）：２２８－２３７．　Ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＡＨｓ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｙ　ｗａｔｅｒ－ｓｉｌｉｃｏｎｅ　ｏｉｌ　ｓｙｓｔｅｍ　ＬＩＵ　Ｆａｎｇ，ＬＩＡＮＧ　Ｊｉｎｓｏｎｇ，ＬＩ　Ｊｉ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００１９３，Ｃｈｉｎａ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ＰＡｉｌｓ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｗａｔｅｒ—ｓｉｌｉｃｏｎｅ　ｏｉｌ　ｂｉｐｈａｓｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ：５０　ｍＬ　ＭＳＭ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ＋１　０　ｍＬ　ｓｉｌｉｃｏｎｅ　ｏｉｌ．Ｔｈｅ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ　ｉｓ　４５％，ｆｌｕｏｒａｎｔｈｅｎｅ　ｉｓ　９９％，ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ　ｉｓ　２７％，ｂｙ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ．Ｗｅ　ｇｏｔ　ａ　ｈｉｇｈ　ｂｉｏ—　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｓｔｒａｉｎ　Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ　ｙａｎｏｉｋｕｙａｅ　ＬＤ２９，ａｎ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ　ｈａｓ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ａｌｓｏ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｗａｔｅｒ－ｓｉｌｉｃｏｎｅ　ｏｉｌ；ＰＡＨｓ；ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ