第５３卷２０１７年第３期 Ｖｏ１．５３ ２０１７ Ｎｏ．３ 西北师范大学学报（自然科学版） ９３ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ） ＤＯＩ：１０．１６７８３／ｊ．ｃｎｋｉ．ｎｗｎｕｚ．２０１７．０３．０１７ 黄连素通过提高活性氧水平促进ＨｅｐＧ２细胞凋亡 刘，李贵琛，孙志鹏，丁 兰，田艳琳 （西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州 ７３００７０） 摘要：本研究用ＳＲＢ法、流式细胞术和荧光显微技术等方法检测分析了黄连素对人肝癌细胞株ＨｅｐＧ－２的毒性并探 究了其作用机制．结果显示，黄连素的毒性作用呈时间一剂量依赖效应，２４ ｈ和４８ ｈ的ＩＣ 。值分别为４４．１０“ｍｏｌ・Ｌ 和８．５３／￣ｍｏｌ・Ｌ ｝１６０“ｍｏｌ・Ｌ 时黄连素具有致死效应；当加入抗氧化剂ＮＡＣ，黄莲素抑制和致死作用明显减弱． 黄连素可引起ＨｅｐＧ－２细胞凋亡，ＮＡＣ作用后细胞凋亡率降低；黄连素可使胞内ＲＯＳ含量持续升高；同时在黄连素 作用下还降低了细胞内抗氧化剂ＧＳＨ含量．表明黄连素可以通过提高细胞内ＲＯＳ，耗竭胞内抗氧化剂进而诱导肝癌 细胞凋亡． 关键词：黄连素；Ｈｅｐ ２细胞；细胞凋亡；活性氧 中图分类号：Ｒ ９６３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１—９８８ Ｘ（２０１７）０３—００９３—０７ Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＨｅｐＧ一２ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ＬＩＵ Ｇｕｏ－ａｎ，ＬＩ Ｇｕｉ－ｃｈｅｎ，ＳＵＮ Ｚｈｉ—ｐｅｎｇ，ＤＩＮＧ Ｌａｎ，ＴＩＡＮ Ｙａｎ—ｌｉｎ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０，Ｇａｎｓｕ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ａｉｍｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｌｍｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｃｕｓｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＳＲＢ，ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｄｏｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｐｒｏ１ｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ＨｅｐＧ一２． ＩＣ５ｏ ｗｅｒｅ ４４．１Ｏ ｍｏ卜Ｌ＿。ａｎｄ ８．５３／，ｍｏｌ・Ｌ—ｗｈｅｎ ｔｒｅａｔｅｄ ２４ ｈ ａｎｄ ４８ ｈ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｂｕｔ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｐｐｅａｒｅｄ ｗｈｅｎ １ ６０／ａｍｏｌ・Ｌ～ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅａｔｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｂｌｏｃｋｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｎ—ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＮＡＣ）．Ａｎｄ，ｏｕｒ ｆｉｎｄ ｔｈａｔ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｐｌｅｔｅｄ ＧＳＨ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｗｅ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈａｔ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｍａｙ ｂｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｓ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｕｃｉｎｏｍａ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ；ＨｅｐＧ一２ ｃｅｌｌ；ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ＲＯＳ 恶性程度最高的肿瘤之 肝癌是全球最常见、 一历史，从丰富的中药宝库中寻找低毒高效的抗癌药 物，是生物医学研究中一项极有希望和意义的工 作．黄连素也称小檗碱（ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ），是一种从黄 连、黄柏或三棵针等数十种中药材中提取得到的一 ．而我国更是肝癌高发 区，肝癌长期占居恶性肿 瘤死因的第二位．应用于癌症临床治疗的化疗药物 对靶细胞杀伤具有非特异性，对人体组织器官可造 成不同程度的毒副作用，过量时可损伤人体自身免 疫系统，严重时可致其死亡．中医中药有着悠久的 收稿日期：２０１６—１１－０２；修改稿收到日期：２０１６—１２—０７ 种季胺类化合物，属于异喹啉生物碱，是传统中药 的有效成分，具有药理作用广泛、使用安全等特 基金项目：教育部留学回国人员科研启动基金资助项目 作者简介：刘（１９６４一），女，河北滦南人，教授，博士，硕士研究生导师．主要研究方向为生物化学与药理学 Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕｇｕｏａｎ＠ｎｗｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 西９４ 北师范大学学报（自然科学版） 第５３卷 Ｖｏ１．５３ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ） 点 ］．黄连素的抗癌活性研究报道亦有不少［２］． 近年来的研究结果显示，活性氧（Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ （Ｕｎ—ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｔｒｉｓ—ｂａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＰＨ １０．５）溶解与 蛋白质结合的ＳＲＢ，后经振荡器摇匀，酶标仪检 测ＯＤ 值．细胞增殖率（ ）一（Ｔ—Ｔ。）／（Ｃ—Ｔ。） ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）参与细胞的多种生理病理过程，如细 胞的增殖、分化和凋亡，与病毒感染、慢性炎症和 肿瘤的发生、发展及浸润等病理过程密切相关．不 ×１００，其中，ｃ为对照组吸光值；Ｔ为处理组吸 光值，Ｔ。加药组吸光值．回归方程计算５Ｏ 增殖 抑制率的药物浓度（Ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＩＣ５ｏ）． 同来源的刺激可诱导细胞产生内源性ＲＯＳ，活性 氧分子又以第二信使的形式改变胞内氧化还原水 平，调节增殖、分化和凋亡相关细胞信号转导通路 中多个靶分子的活性，最终决定细胞命运 ］． 本文拟通过细胞毒性、细胞形态学及流式细胞 术分析，检测黄连素对肝癌细胞ＨｅｐＧ一２细胞生长 的影响，从ＲＯＳ和抗氧化性两方面探讨其毒性机 理与ＲＯＳ的可能关系，为黄连素用于肝癌的治疗 提供更多依据． １．２．３ 倒置光学显微镜观察ＨｅｐＧ～２细胞生长状 态 取对数生长期的ＨｅｐＧ一２细胞以１０×１Ｏ 个・ ｍＬ 浓度接种于６孑Ｌ板中，每孔１．５ ｍＩ ，培养 ２４ ｈ后，加入黄连素、ＮＡＣ后培养２４ ｈ，倒置光 学显微镜下观察并拍照． １．２．４ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８荧光显色法检测细胞核形 态变化ＨｅｐＧ一２细胞以１０×１Ｏ 个・ｍＬ 浓度接 １材料与方法 １．１ 材料 种于６孔板中培养２４ ｈ后，加药处理２４ ｈ后收集 细胞，经预冷ＰＢＳ（４℃）洗２次，冰醋酸一甲醇 （１：３）于４℃冰箱内固定３０ ｍｉｎ，预冷ＰＢＳ洗２ 次，涂片，晾干．加入１０ ｇ・ｍＬ 的Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８，经室温避光染色１０ ｍｉｎ，蒸馏水冲洗染 液，避光晾干后保存，荧光显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＦＸ一 ３５ＷＡ，Ｊａｐａｎ）下观察（激发波长３４０ ｎｍ）细胞核形 态，拍照． １．２．５ 流式细胞术检测细胞周期变化与细胞凋亡 人肝癌细胞株ＨｅｐＧ一２由兰州大学王春明教授 惠赠． ＲＰＭＩ一１６４０培养基购自美国Ｇｉｂｃｏ公司，小 牛血清购自杭州四季青生物科技公司，黄酰罗丹 明Ｂ（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ，ＳＲＢ）购自东京化成工业株 式会社，胰蛋白酶、吉姆萨染色剂、碘化丙啶 （Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）、黄连素（Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）、吖啶 橙（ＡＯ）和溴化乙锭（ＥＢ）均购自Ｓｉｇｍａ公司， ＲＮａｓｅ Ａ购自北京索来宝生物科技有限公司， ＮＡＣ（Ｎ—ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ，即Ｎ一乙酰半胱氨酸）、 活性氧检测试剂盒、ＧＳＨ与ＧＳＳＨ检测试剂盒均 购自江苏碧云天生物科技有限公司，Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ— ＦＩＴＣ购自美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司，二甲基亚砜购自 美国Ｍｅｒｃｋ公司，其它试剂均为国产分析纯． １．２ 方法 细胞接于６孔板中培养２４ ｈ，药物处理２４ ｈ后 收集细胞，预冷的ＰＢＳ洗２次，７０ 乙醇一２０℃ 下固定２４ ｈ．ＰＢＳ洗２次，加入ＲＮａｓｅ Ａ，３７℃ 避光温育３０ ｍｉｎ，再加入ＰＩ，４℃避光孵育 ３０ ｍｉｎ．经２６０目（孔径约５Ｏ Ｆｒｏ）尼龙网过滤，流 式细胞仪检测并分析细胞周期．Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ—ＦＩＴＣ／ ＰＩ双染法流式细胞术检测细胞凋亡，Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ— ＦＩＴＣ／ＰＩ双染后１ ｈ内经流式细胞仪检测并分析细 胞凋亡 ． １．２．１ 细胞培养 人肝癌细胞ＨｅｐＧ一２培养于 ＲＰＭＩ一１６４０完全培养基中（内含１０ 灭活小牛血 清、１００ Ｕ・ｍＬ 青霉素和１００ ｐｔｇ・ｍＬ 链霉素）， 置于５％ＣＯ 饱和湿度恒温箱（３７℃）中培养，取 对数生长期细胞用于实验． １．２．６ ＤＣＦＨ—ＤＡ单染色法检测ＨｅｐＧ一２细胞内 ＲｏＳ含量的变化 细胞预培养２４ ｈ，经药物处理 ２４ ｈ后收集细胞，ＰＢＳ洗涤之后装载１０ ｔｏｏｌ・Ｉ ＤＣＦＨ—ＤＡ荧光探针，３７℃孵育３０ ｍｉｎ，预冷 ＰＢＳ洗涤细胞２次去除未进人细胞内的ＤＣＦＨ— １．２．２ ｓＲＢ法测定药物对ＨｅｐＧ一２细胞的毒性 取对数生长期细胞以１０×１Ｏ 个・ｍＬ 浓度接种 ＤＡ．荧光显微镜下观察（激发波长４８８ ｎｍ）ＲＯＳ 的分布情况或补充ＰＢＳ缓冲液（室温）３００“Ｌ流式 细胞仪检测ＲＯＳ． １．２．７ 比色法检测ＨｅｐＧ一２细胞内ＧＳＨ含量的变 于９６孔板，每孑Ｌ １００ Ｌ，培养２４ ｈ后，分别加入 １Ｏ，２０，４０，１６０／￣ｍｏｌ・Ｌ 的黄连素和５ ｍｍｏｌ・Ｌ 的 ＮＡＣ．继续培养２４，４８ ｈ后，加１Ｏ 三氯乙酸置 化 细胞按试剂盒使用说明书处理并测定． １．２．８数据统计 对所得数据进行方差分析和ｔ 于４℃冰箱中固定１ ｈ，水洗并干燥．以Ｔｒｉｓ溶液 ２０１７年第３期 ２Ｏ１７ Ｎｏ．３ 刘等：黄连素通过提高活性氧水平促进ＨｅｐＧ－２细胞凋亡 ＴＢＪｑ ０占 圳 Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＨｅｐＧ－２ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ∞ ∞ 踟 ∞ ∞ ０ 检验，实验重复３次以上，结果以ｍｅａｎ±ＳＤ表 示，Ｐ≤０．０５为差异显著，Ｐ≤０．０１为差异极显 著． ０ ｕ ｍｏｌ－Ｌ １Ｏ ｕ ｍｏｌ・Ｌ ２０ ｕｍｏｌ・Ｌ ４０ ｕ ｍｏｌ・Ｌ‘ ８０ ｕ ｍｏｌ・Ｌ ｌ６０¨１１１０ｌ・Ｌ‘ ６２．８４ ． １６０／￣ｍｏ［・Ｌ 黄连素联合ｓ ｍｍｏｌ・Ｉ ＮＡＣ后， 细胞增殖得到明显提高． １２０ １００ 皇 ８０ 善 ６ｏ ０ 斟４０ ２Ｏ Ｏ ＣＫ Ｎ Ｂ４５ Ｂ１ ６０ Ｂ４５＋ＮＢｌ６Ｏ＋Ｎ 处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｕ ｔｏｏｌ・Ｌ 图２ 黄连素联合ＮＡＣ对ＨｅｐＧ－２细胞增殖的抑制作Ｈ｛ 图ｌ 黄连素对ＨｅｐＧ－２细胞增殖的抑制作用 Ｆｉｇ １ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｒｂｒｉｎｅ ｔＯ ＨｅｐＧ－２ ｃｅｌｌｓ Ｆｉｇ ２ Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｒｂｒｉｎｅ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＮＡＣ ｔＯ ＨｅｐＧ一２ ｃｅｌｌｓ ２ 结果 ２．１ 黄连素及联合ＮＡＯ对细胞增长率的影响 ＣＫ．对照组；Ｎ．５ ｍｍｏｌ・Ｌ ＮＡＣ； ｔ３４５．４５／，ｔｏｏｌ・Ｌ 黄连素；Ｂ１６０．１６０ ｂｍ￣ｏｌ－Ｉ 黄连素； Ｂ４５＋Ｎ．４５“ｍｏＩ・Ｌ 黄连素＋５ ｍｍｏ］・Ｉ Ｂ１６Ｏ＋Ｎ．１６０“ｔｏｏｌ・Ｉ 黄连素＋５ ｍｍｏｌ・Ｉ ＮＡ（、； 由ＳＲＢ检测结果显示，不同浓度黄连素对 ＮＡＣ． ＨｅｐＧ一２细胞增殖均有抑制（图１），联合５ ｍｍｏｌ・ Ｌ ＮＡＣ后较黄连素单独处理组细胞增殖抑制减 弱（图２）．在浓度ｌＯ～１６０／，ｍｏｌ・Ｉ 一 的范围内，经 不同时间处理后黄连素对ＨｅｐＧ一２细胞的增殖抑制 率均随其浓度增大而降低．经２４ ｈ和４８ ｈ处理后 的ＩＣ５。值分别为４４．１０和８．５３ ｍｏ１・Ｉ ； １６０“ｍｏｌ・Ｉ 时，均表现为致死效应．较 Ｐ＜０．０５与对照组相比； Ｐ＜０．０１与对照组相比； Ｐ＜Ｏ．Ｏ１与１６０ ｐｔｍｏｌ・Ｉ 处理组相比 ２．２ ＮＡＯ对黄连素引起的细胞形态学的影响 倒置显微镜观察发现（图３），黄连素处理后细 胞形态发生明显变化，对照组（图３：Ａ）细胞充分铺 展，折光性强，呈不规则梭形或多边形．处理后大 部分细胞回缩变圆。胞体缩小，部分细胞丧失贴壁 性．ＨｅｐＧ一２细胞经１６０ ｌ，ｍｏｌ・Ｉ 黄连素处理后形 态变化明显．显微镜下可观察到大部分细胞胞体明 ４５肚ｍｏｌ・Ｉ 黄连素单独作用、与５ ｍｍｏ｜・Ｉ ＮＡＣ 联合作用时，细胞增殖抑制率由４９．８６ 上升至 图３倒置显微镜观察黄连素引起的ＨｅｐＧ－２细胞损伤 Ｆｉｇ ３ Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｂｅｒｂｒｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ＨｅｐＣｒ－２ ｃｅｉｌｓ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（×２００） Ａ．空白对照；Ｂ．４５“ｍｏ卜Ｉ 黄连素；Ｃ．１６０ ｌ，ｎａｏｌ・Ｉ 黄连素；Ｄ．５ ｍｍｏｌ・Ｌ ＮＡＣ； Ｅ．４５ ｍｏｌ・Ｉ 黄连素＋５ ｍｍｏｌ・Ｉ ＮＡｃ；Ｆ．ｔ ６０ ｔ，ｍｏｌ・Ｉ 黄连素＋５ ｍｍｏｔ・Ｉ ＮＡＣ． 西北师范大学 学报（自然科学版） 第５３卷 Ｖｏ１．５３ ｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕ ｌｉｖｅｒｓｉｔｖ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ） 显缩小、细胞失去贴壁性并伴随有部分细胞漂浮于 培养基中（图３：Ｂ．Ｃ，Ｄ）；联合ＮＡＣ后，较前者贴 壁细胞增多，不规则梭形和多边形细胞也增多 （图３：Ｅ，Ｆ）． 及细胞核变小、皱缩，染色质凝聚、边缘化，呈现 凋亡形态；经１６０／￣ｍｏｌ・Ｉ 黄连素处理后的细胞， 镜下观察凋亡细胞比率增加，凋亡细胞特征性形态 更加明 （图４：Ｂ，【 ）．当５ ｍｍｏｌ・Ｉ ‘ＮＡＣ联合 不同浓度黄连素之后，一些细胞大小恢复，轮廓较 清晰，染色质分布较均匀．镜下观察凋亡细胞比例 较之减少（图４：Ｄ，Ｅ．Ｆ）． 荧光染料Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８对细胞核染色的结果 表明，ＮＡＣ对黄连素引起的损伤有保护作用．未 处理组细胞核荧光分布均匀，呈圆形，轮廓清晰。 大小均一（图４：Ａ）．黄连素处理后，部分细胞体积 图４ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８荧光染色观察细胞核变化（×２００） Ｆｉｇ ４ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｈｏｃｈｅｓｔ ３３２５８ ｓｔａｉｎｉｎｇ（×２００） Ａ．空白对照；Ｂ．４５ ｇｍｏｌ・Ｌ 黄连素；Ｃ．１６０／￣ｍｏｌ・Ｌ 黄连素；Ｄ．５ ｍｍｏｌ・Ｉ ＮＡ（ Ｅ－４５／ｚｍｏｌ。Ｌ 黄连素＋５ ｍｍｏｌ・【 ＮＡＣ；Ｆ．１６０／￣ｍｏｌ・Ｉ 黄连素＋５ ｍｍｏｌ・Ｌ ＮＡ（ 黄连素处理后ＨｅｐＧ一２细胞表现 细胞凋亡的 特征，而在联合ＮＡＣ处理之后，细胞凋亡形态特 征明显得到缓解，说明５ ｍｍｏｌ・Ｉ ＮＡＣ对由黄 连索引起的ＨｅｐＧ一２损伤具有一定的抑制作用． ２．３ ＮＡＯ对黄连素引起的ＨｅｐＧ一２细胞凋亡的影 响 、 盖重・ｓ 罂 再 膝 ０ ｌ０ ５ ｊ ｕ 细胞经ＮＡＣ保护黄连素处理的检测结果如图 ５．４５／ｔｒｎｏｌ・Ｉ 和１６０／ｔｍｏｌ・Ｉ 黄连素可以诱导 １ ５．５＂３ 和２（）．１３ 的细胞发生凋亡．而当加入 ∞ Ｂ４５ Ｂ １６０ Ｂ４５＋Ｎ Ｂ１６０＋Ｎ 处理＂Ｉｒｅａｒｍ￣ｎｔ／ ｍｏ１．Ｌ ＮＡＣ后，凋亡率分别下降至１０．９３％和１４．７３ ． 用流式细胞仪分析经Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ—ＦＩＴＣ／ＰＩ双染处 理的细胞样品，结果显示（图６），４５“ｍｏｌ・Ｌ ｔ。 图５ 流式细胞仪分析ＳｕｂＧ１期细胞 Ｆｉｇ ５ ＳｕｂＧ１ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ＦＡＣＳ Ｂ４５．４５／ｚｍｏｌ・Ｌ 黄连素；Ｂ１６０．１６０ｈｔｏｏｌ・Ｊｔ 黄 连素； Ｂ４５＋Ｎ．４５／￣ｍｏｌ・Ｌ 黄连素＋５ ｍｍｏｌ・Ｌ ＮＡＣ；Ｂ１６Ｏ＋Ｎ．１６０／ｚｒｎｏｌ・Ｉ 黄连素＋５ｍｍｏｌ・Ｉ ＮＡＣ． １６Ｏ／ｌｍｏｌ・Ｉ 黄连素引起的细胞晚期凋亡率为 ｌ７。０５ 和３２．（）９ （冈６：Ａ．Ｂ．（、，Ｉ））， ＮＡＣ处婵 后下降至１５．Ｏ６ 和２８．１ ９ （罔６：Ｅ，Ｆ）．进一步证 明ＮＡＣ可抑制黄连素诱导的ＨｅｐＣ－２细胞凋 ． ．Ｐ＜０．０１与４５／￣ｍｏｌ・Ｉ 黄连素处理组相比； Ｐ＜ ０ｌ与１６０／ｔｍｏｌ・Ｌ。黄连素相比． ２ＯＩ ７年 ２０ｌ ７ ＮＯ ｉ ｉｎ Ｈ ｕ（；２ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｃｌｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ） 空 自 ｌ１ ２％ ．．、 ｝秘藩 。 ２ ｌ。 ３ ∽ 暇～刚 黄 ：㈨ 连 粜 蠢 鲁 三 一一 兰兰 ∽ 量ｂ 呈一 暑 － ｃ， ．拳 － ．专 ６ｌ ３ ０ ０ ’’【 ■ 一 ０ 一 ｔ． ０毒： ＂连黄小 Ｌ ≮ ‘ ： ３４ ２ ７ 索 １０ ｌ０ （１．３５０ ＿ｏｌ １ ０ ４８ １０ ¨… １０ １０ １０ ｌ０ １ Ｏ １｛ ｌ０。。 ０。 １Ｏ １０。 １０ ＦＬ １ Ｉ ｌＵ ０ｒｅｆ１ ＳＣＣＩＩｃ ｅ Ａ ＦＬ１ Ｆｌｕｏｌ’ＣＩＩＳＣＣｌｉｃｅ Ｂ ＦＬ１ Ｆｌｕ ｏｒｃｉｉ ｓｃｃｎｃｅ ｍ ㈣ Ｆ ． 刊… Ｔ 【 ｗ ０ ＝ 尉 兰析＿分 法０采姑 双 时Ｌ 连 ．ｍ＾：连 ｍ ｌ采 三 ｌ 上 ｒＯ ＦＬ １ Ｆ／ｕｏｒｃｎ ｓｃｅｎｃｅ Ｄ ＦＬｉ Ｆ ＯＩ’ＣＩＩＳＣｅｎｃｅ ＦＬ１ Ｆ Ｌｌ０ｒＣｔＩＳＣｅ ｒＩＣｅ 牢 Ｌ ） 印 Ｎ ●， ２．４ ＮＡＣ对黄连素处理细胞中ＲＯＳ和ＧＳＨ的影 响 ＮＡ 处理后． 适素处理 细胞的｝ 性轼水平 卜降（ ７：Ｉ）．Ｅ，Ｆ）．细胞１人】ＧＳｔ ｔ ＆Ｊ 细胞的瓴化还原状态。 连求处 细胞 ：（ ７：ｌ｛Ｉ【、）． 一定程度代 从 ７Ａ可看到对照纠Ｉ细胞仃擞微刺的绿包荧 ， ８的测定结果 明。 ｌ ５ ＩｌｌＯＩ・Ｉ 和１“（】ｆ ＤＩ（）Ｉ・Ｉ 增『 处 （；．１２．２，１ ｈ ｆＩ１ｆ．鳆连索处理！ｌ 笄（Ｐ：２ｏ．Ｏ１）降低 ｒ ｔｉｌｔ Ｊ旭・ｌ¨ ＳＩ｛的水 ．』Ｊ口人ＮＡ｛、Ｊ ． 荧光明显增强，表明｝ ７ ＮＡＣ使得黄连素１１“的Ｉｔ（）ｓ水平降低 Ｆｉｇ ７ ＮＡ（、ｄｅｃｌｉｎｅ Ｒ（）Ｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈａｔ １３｛・Ｉ‘ｈｅｒ 、．空白对照；Ｂ．１ ５｝ｚｇｎｏｌ・ｌ Ｅ．１ ５ ｆｌｎ１ｏＩ．Ｉ 黄连袭 连素；（、．１ ６０ ｔ，ｏｏｌｔ・Ｉ 战适裘；Ｉ）．５・ 西９８ 北师范大学学报（自然科学版） 第５３卷 Ｖｏ１．５３ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ） 一二０吕Ｔ＇～雹∞０ ０岛０一 暑ｌｌｏｕ口０Ｕ 正常组织造成毒副作用．因此，降低化疗药物毒 黄连素各处理时间段的ＧＳＨ水平均上升，而 １６０“ｍｏｌ・Ｌ 黄连素只有６ ｈ处理组有明显回升． 经ＤＣＦＨ—ＤＡ染色后，流式细胞术可定量检测细 胞ＲＯＳ含量．比较４５ ｔｚｍｏｌ・Ｌ 黄连素处理后细 胞ＧＳＨ水平和ＲＯＳ活性结果可明显看出（图９）两 性，保证疗效并提高药物安全性是开发抗肿瘤药物 的一大挑战．研究发现，几乎所有肿瘤细胞均有一 个共同点，即胞内活性氧水平上升．但胞内抗氧化 酶活性较正常细胞低，对活性氧的清除效率降 低 ］．若肿瘤细胞与正常细胞中的ＲＯＳ含量处于 同一水平，则前者对ＲＯＳ更敏感．这说明ＲＯＳ可 者的反向对应关系，进一步证明了黄连素促进 ＨｅｐＧ２细胞释放ＲＯＳ，并使得胞内ＧＳＨ水平降 低，表明细胞处于氧胁迫状态． １．２ 蚓 缸 Ｚ ∞ ０ Ｏ ．Ｏ．２ 图８ ＮＡＣ提高了黄连素降低的ＧＳＨ浓度 Ｆｉｇ ８ Ｂ．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＨ ｈａｓ ａｓｃｅｎｄ ａｆｔｅｒ ＮＡＣ ｗｈｉｃｈ ｂｅｅｎ ｆａｌｌ ｂｙ Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ＣＫ＿对照组；Ｎ．５ ｍｍｏｌ・Ｌ—ＮＡＣ；１３４５．４５ ｔ￣ｍｏｌ・Ｌ 黄连素；Ｂ１６０．１６０ ｔ２ｍｏｌ・Ｌ～ 黄连素；Ｂ４５＋Ｎ．４５ ｔ２ｍｏｌ・ Ｌ 黄连素＋５ ｍｍｏｌ・Ｌ ＮＡＣ；Ｂ１６０＋Ｎ．１６０ ｔＪｍｏｌ・Ｌ＿。 黄连素＋５ ｍｍｏｌ・Ｌ ＮＡＣ． ＊Ｐ＜Ｏ．０５， ＜０．０１与对照组相比； Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ ＜Ｏ．０１与４５ ｔ￣ｍｏｌ・Ｌ 黄连素处理组相比； Ｐ＜０．０１与 时闻Ｔｉｍｅ／ｈ 图９ ４５／￣ｍｏｌ・Ｌ＿１黄连素对细胞 ＲＯＳ和ＧＳＨ的影响 Ｆｉｇ ９ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＲＯＳ ａｎｄ ＧＳＨ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ４５／２ｍｏｌ・Ｌ一 Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｉｎ ＨｅｐＧ－２ ｃｅｌｌｓ ３讨论 目前应用于临床的大部分生化药物都不具有区 分正常细胞和肿瘤细胞的能力．治疗过程中，常对 选择性地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞的损伤则相 对较低．如抗氧化剂一维生素Ｃ，在药理学浓度下 以促氧化形式诱导胞内产生Ｈ。Ｏ。损伤癌细胞，并 诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞却无影响ｌ６］，这 说明生物抗氧化剂的促氧化性在癌症预防中可能发 挥着重要作用＿７］．且相较于大多数肿瘤细胞，正 常细胞对ＲＯＳ更具有耐受性ｌ８］． 本实验中ＳＲＢ法结果显示，黄连素对ＨｅｐＧ一２ 细胞具有一定的毒性，并呈时间一剂量依赖效应． 显微镜观察，黄连素可使ＨｅｐＧ一２细胞失去贴壁能 力，使胞体收缩变圆，核内出现染色质凝集、边缘 化及核碎裂等细胞凋亡的基本形态特征．凋亡结果 也表明，４５“ｔｏｏｌ・Ｌ一 黄连素可能够起ＨｅｐＧ一２细 胞凋亡，１６０￣ｔｍｏｌ・Ｌ 黄连素处理组早期凋亡和 晚期凋亡率明显上升．同时，细胞周期结果显示， ＨｅｐＧ一２细胞受黄连素处理２４ ｈ后出现Ｓｕｂ—Ｇ１ 期．经ＮＡＣ抑制后，ＨｅｐＧ一２细胞凋亡形态特征 得到改善，Ｓｕｂ—Ｇ１期细胞比例下降，凋亡率有所 降低．荧光显微镜观察胞内ＲＯｓ分布和流式检测 ＤＣＦ荧光强度结果表明，４５ ｔ￣ｍｏｌ・Ｌ 和１６０ ｔｚｍｏｌ ・Ｌ 黄连素分别处理ＨｅｐＧ－２细胞６，１２，２４ ｈ后， 胞内ＲＯＳ含量均上升，与黄连素的作用存在时间一 剂量效应．ＧＳＨ是绝大多数活细胞中蛋白巯基的 主要来源，是动植物细胞中关键的抗氧化剂ｌｇ］． 比色法检测ＧＳＨ后发现，４５ ｔ￣ｍｏｌ・Ｉ 和 １６０／￣ｍｏｌ・Ｌ 黄连素作用６，１２，２４ ｈ后可使胞内 ＧＳＨ含量显著下降，并表现为作用时间一剂量依赖 负效应．ＮＡＣ处理后，被黄连素降低的ＧＳＨ含 量得到了显著提升，而且升高的ＲＯｓ含量则显著 降低．同时其他传统抗氧化化合物可能在一定浓度 范围内表现为促氧化［１ ，也可诱导癌细胞凋亡． 黄连素具有一定的抗氧化活性ｌ１ ．Ｌｉｕ等 ］ 证明了黄连素可增强Ｘ射线诱导肿瘤细胞凋亡的 作用．张卫东［１ 、林庆新ｌ１。 的分析表明，可能通 过增加Ｃａｓｐａｓｅ一３，上调ｐ５３蛋白表达、下调 ＢＣＬ－２蛋白表达来诱导ＨｅｐＧ－２细胞凋亡，Ｓｈｕｋｌａ ２０１７年第３期 ２Ｏ１７ ＮＯ．３ 刘等：黄连素通过提高活性氧水平促进ＨｅｐＧ２细胞凋亡 Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＨｅｐＧ－２ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ９９ 的研究进一步揭示了黄连素抑制去乙酰化酶，导致 ＦｏｘＯ１／３ａ和ｐ５３乙酰化后，激活ＢＨ３一ｏｎｌｙ蛋白 Ｂｉｍ／ＰＵＭＡ，这些可能和线粒体介导的凋亡有 关 ］．ＲＯＳ和肿瘤的关系比较复杂，其作用可能 和ＲＯＳ的种类、浓度以及细胞的类型都有关 ， 它可能通过激活细胞凋亡信号通路诱导细胞凋 亡 ． 黄连素可诱导肝癌细胞ＨｅｐＧ一２发生凋亡，这 可能与细胞ＲＯＳ水平升高、导致ＧＳＨ耗竭、激 活细胞凋亡通路有关，这为黄连素在肝癌治疗中的 应用提供了一些思路． 参考文献： ［１］ ＬＥＴＡＳ１０ＶＡ Ｓ，ＪＡＮＴＯＶＡ Ｓ，ＭＵＥＫＯＶＡ Ｍ，ｅｔ ａ１． Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｃｒｂｅｒｉｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｎｄ Ｐａｐ Ｍｅｄ Ｆａｃ Ｕｎｉｖ Ｐａｌａｃｋｙ ＯｌｏｍｏｕｃＣｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂ，２００５，４９（２）：４６１ ［２］ 王海燕，赵雪花，何丽娅．黄连素抗癌作用的分子 机制［Ｊ］．中国药房，２００７，１８（３）：２２１． ［３］ 景亚武，易静，高飞，等．活性氧：从毒性分子到 信号分子［Ｊ］．细胞生物学杂志。２００３，２５（４）： １９７． ［４］ 梁智辉，朱慧芬，陈九武．流式细胞术基本原理与 实用技术［Ｍ］．武汉：华中科技大学出版社，２００８． ［５］ ＣＬＥＶＥＬＡＮＤ Ｊ Ｌ，ＫＡＳＴＡＮ Ｍ Ｂ． Ｃａｎｃｅｒ：ａ ｒａｄｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔＯ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０００， ４０７（６８０２）：３０９． ［６］ ＣＨＥＮ Ｑ，ＥＳＰＥＹ Ｍ Ｇ，ＳＵＮ Ａ Ｙ，ｅｔ ａ１． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｏｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２００８， １０５（３２）：１１１０５． ［７］ 周波．生物抗氧化剂的促氧化作用及其癌预防活性 ［Ｊ］．井冈山大学学报（自然科学版），２０１０，３１（１）： ９８ ［８］ 西川Ｉ学，秦丽娟，薛一雪．氧化应激与癌症治疗 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ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２０００，５（５）： ４１５． ［１６］刘，薛莹，马伟等．番茄红素的抗氧化活性究 ［Ｊ］．西北师范大学学报（自然科学版），２０１６， ５２（２）：８９． ［１７］ＬＩＵ Ｂ，ＷＡＮＧ Ｑ，ＹＵＡＮ ＤＤ，ｅｔ ａ１．Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉｚｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｘ－ｒａｙｓ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｐ ｊ ｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］． ＣｈｉｎＭｅｄ Ｊ（Ｅｎｇ１），２０１１，１２４（８）：１２２１． （责任编辑俞诗源）
